Utilizzando il Elettroretinogramma per valutare la funzione in roditori Retina e gli effetti protettivi del Remote Limb ischemico precondizionamento

Summary

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Abstract

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the ‘flash’ ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

Introduction

L'ERG è un potenziale elettrico generato dalla retina in risposta alla luce, e registrato dalla superficie corneale dell'occhio. Quando le condizioni di registrazione vengono gestite accuratamente, l'ERG può essere utilizzato in una varietà di modi per valutare la funzione retinica. Qui abbiamo descritto come registrare il 'Flash ERG', il potenziale generato quando la retina è esposto a un breve lampo, luminoso presentato in uno sfondo Ganzfeld. Il Ganzfeld disperde la luce in modo omogeneo e il lampo di luce raggiunge tutta la retina di circa uniforme. Se la retina è scuro adattato prima della registrazione, e il buio-adattamento è mantenuto come l'animale è preparato per la registrazione, l'ERG ha ottenuto è generato da due bastoncelli e coni.

Il-scuro adattato Flash ERG ha una forma d'onda caratteristica, che è stato analizzato in due modi. Innanzitutto, precoci e tardive componenti della forma d'onda ERG sono stati distinti, e relativi alla sequenza di neuroneal attivazione nella retina. Il primo componente è una breve latenza andamento negativo potenziale, l'a-onda (Figura 1). Questo è seguito da un potenziale positivo continuo, chiamato b-wave. La fase di salita del b-wave mostra oscillazioni, che sono considerate un componente separato (potenziali oscillatori o PO). L'a-onda è considerato essere generato da fotorecettori, il b-wave dalle cellule dello strato nucleare interno e dei PO dalle cellule amacrine ^1.

Sulla base della forza dello stimolo, risposte a molto fioche lampeggia definito la risposta di soglia scotopica sono possibili. La risposta di soglia scotopica è inteso essere generato dalle cellule gangliari retiniche ^2-4. In secondo luogo, il flash ERG può essere separata da adattamento alla luce, o da un protocollo due Flash descritto di seguito, in componenti di noccioli e cono guidato. In condizioni fotopiche, l'a-onda non è rilevabile nei ratti, perché la popolazione cono è basso, ma PO e un b-wave sonochiaro ^5. Nei primati, le cui retine avere popolazioni cono più elevati, sia Rod- e percorsi di cono generano un rilevabile un onda ^6.

Due misure utili spesso estratte dal flash ERG sono le ampiezze dei a- e b-onde, misurate come nella figura 1, con risposte in flash tipici mostrati in Figura 2. Quando la popolazione fotorecettore è ridotto, per esempio mediante esposizione a pericolosamente luminoso luce, tutti i componenti del ERG sono ridotti. Interventi neuroprotettivi, come ad esempio a distanza precondizionamento ischemico (RIP), possono essere convalidati dalla conservazione delle ampiezze delle a- e b-onde (Figura 3). In sintesi, l'analisi della ERG consente confronti tra sano, leggero e della retina danneggiate neuroprotected.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di Università di Sydney. 1. Realizzazione di elettrodi Costruire l'elettrodo positivo (quello che contattare la cornea) da un breve (5 cm) lunghezza del filo di platino 1-2 mm di diametro. Adatti in un loop di pochi mm di diametro. Collegare questo circuito ad un cavo tradizionale, abbastanza a lungo per raggiungere la fase di ingresso dell'amplificatore (vedi Figura 4). Costruire …

Representative Results

Il protocollo può essere utilizzato per misurare la funzione visiva di roditore retina in vivo. L'a-onda, una misura della funzione fotorecettori, e b-wave, una misura della funzione retina interna, vengono annotati in Figura 1. I asta dominato ERG segnale aumenta con la crescente stimolo luminoso, come mostrato nella figura 2A. L'a-onda diventa chiaro a ~ 0,4 log scot cd.sm -2 e l'ampiezza delle onde un aumenta fino a satura…

Discussion

Il flash metodo di ERG adattata al buio sopra descritto è un metodo affidabile per valutare la funzione della retina nei ratti. Sia l'una-wave e b-wave sono stati ridotti del danno chiaro. Remote precondizionamento ischemico mitigata riduzioni danni indotti luce del un-wave e b-wave. Questa conservazione della funzione retinica suggerisce che a distanza precondizionamento ischemico ha indotto neuroprotezione, simile ad altre forme di precondizionamento protettivi quali ipossia, ischemia e l'esercizio ^8-10….

Materials

PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquistion of ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Amplifier for ERG
Lab chart	AD Instruments		Signal collection software
Ganzfield	Photometric solutions	FS-250A	Light stimulus
Ganzfield operating system	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	calibrate light series
Lux meter		LX-1010B	check red light illumanation
Excel	microsoft
Lead wires	AD Instruments		Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires -aligator	AD Instruments		ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95%	A&E metals		postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	negative electode
26 gauge needle	BD		ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v	Bausch & Lomb		topical anaesthetic
Visco tears eye drops	Novartis		carbomer polymer
Thread			retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive	Blu tac		Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil – ketamine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociative
Xylium – Xylazine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		muscle relaxant
Scale