Mammosphere Формирование анализа из рака молочной железы человека тканях и клеточных линий
Summary
Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Abstract
Как здоровых тканей, многие крови и твердых злокачественных опухолей в настоящее время считается, организованы иерархически, с подмножеством стволовых-как раковые клетки, которые самообновлению, давая начало более дифференцированной потомства. Понимание и направленности этих раковых стволовых клеток при раке молочной железы, которые могут обладать повышенной химио- и лучевая устойчивость по сравнению с не-опухолевых стволовых оптом, стала важным направлением исследований. Маркеры в том числе CD44, CD24, и ALDH деятельности может быть оценена с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) для перспективно выделения клеток, которые отображают усиление туморогенности при имплантации в ослабленным иммунитетом мышей: mammosphere анализ также стал широко используется для его способности ретроспективно определить Шар формирование клеток, которые развиваются из клеток-как клоны одного стебля. Здесь мы опишем подходы к соответствующей культивирования mammospheres из клеточных линий или первичных проб пациентов, их пассирования, и расчеты для оценки сферы Forming эффективность (SFE). Сначала мы обсудим основные моменты и подводные камни в соответствующем планировании и интерпретации mammosphere экспериментов.
Introduction
Наличие линий опухолевых клеток во главе с стволовых, как раковые стволовые клетки значительно добавил к нашему пониманию опухоли неоднородности. Хотя некоторые фенотипического разнообразия в опухолях действительно возникает из клонального вырост генетически различных клонов, появляется существенный компонент результатом эпигенетических различий: раковые клетки могут перейти (иногда обратимо) между штоком, прародителя и дифференцированных состояний посредством активации или репрессии конкретного гена Программы выражение 1 – 3. Это может отражать клеток внутреннего или внешнего фактора, отражает программу экспрессии генов в настоящее время, выраженное в ячейке с его результирующей аутокринного сигнализации в сочетании с паракринной сигналов от соседних рак, стромальные клетки иммунной системы или доставки модулирующие факторы и microenviromental условия, такие как степень гипоксия 2,4,5.
Хотя инновационных клона отслеживания подходовпродвигаются наши способности к обучению предполагаемых раковых стволовых клеток в их в естественных нише 6 – 8, сфера формирования анализы остаются популярными и удобный подход для оценки потенциала клеток рака молочной железы ", чтобы вести себя как стволовые клетки, по крайней мере, в условиях анализа, используемых. Он часто используется вместе с ретроспективных методов раковых стволовых очистки клеток, их выражения мембранных маркеров CD44 и CD24 9 и уровней активности фермента ALDH (альдегиддегидрогеназой) 10, маркеров, которые были предложены, чтобы соответствовать более mesenchymal- и эпителиальных -как раковые стволовые клетки соответственно 11. Подход формирования сфера была впервые разработана в качестве нейросфера анализа, что позволяет рост предполагаемых стволовых клеток из отдельных клонов в неприлипающими, бессывороточной условиях с добавлением эпителиального фактора роста (EGF) 12, а затем быть с пользой применены к нормальной и раковой тканях молочной железы.
<p claсс = "jove_content"> Личность сфере формирования основателя ячейки и типы смешанных клеток, составляющих массу сфере, имеют отношение к выводам, которые можно сделать из mammo-, или в другой сфере формирования анализов. Долгосрочные покоя кости ФИДЕ стволовые клетки, как полагают, отдохнуть в G0 фазе, не будет испытывать точное сочетание факторов, которые будут благоприятствуют активации в естественных условиях. Mammosphere анализ, а не способствующая росту клеток либо на пороге митотического деления или уже разделительных 13. Эти предшественники, хотя и не действительно покоя клетки, может быть этапом клеток, которые пролиферируют с митогены EGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF), используемых в анализе. Тем не менее, они содержат ряд клеточно-ассоциированного сигнализации активируется стволовых дорожками 14. Кроме того, скорость их образования относится к туморогенности ткани они были взяты из измеренного, когда их активности в анализах ограниченных разведений в ксенотрансплантатов мыши 2,15,16 </ SUP>.Здесь мы предлагаем подробные протоколы, чтобы изолировать отдельные клетки и формировать первичные mammospheres из обеих клеточных линий рака молочной железы человека и в клинических образцах опухолей молочной железы. Мы также описывается, как выполнять последовательные проходы первичных mammospheres оценить самообновление, и как рассчитать сфера формирования эффективность, что позволяет проводить сравнения между разными плотностями высева (см схему на рисунке 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное оценка первичных и вторичных mammospheres зависит от клетки посевом при достаточно низких плотностей, которые mammospheres форму от отдельных клонов, с минимальным агрегации сферы. Однако при плотностях, которые слишком малы, слишком мало mammospheres могут образовывать различать эффекты леч?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Императорского BRC, Национальный институт исследований в области здравоохранения, а также действия по борьбе с раком с особым упоминанием Хилари ремесла и сэра Дугласа Майерс.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
