I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi. Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.
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Articolo metodologico
Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Simile ai tessuti sani, molti di sangue e tumori solidi sono ora pensato di essere organizzati gerarchicamente, con un sottoinsieme di cellule tumorali staminali, come quello auto-rinnovarsi dando origine a una progenie più differenziato. La comprensione e il targeting queste cellule staminali tumorali nel cancro al seno, che può possedere una maggiore chemio e radio-resistenza rispetto alla massa tumorale non-staminali, è diventato un importante settore di ricerca. Marcatori compreso CD44, CD24, e l'attività ALDH possono essere valutati utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per isolare in modo prospettico le cellule che mostrano una maggiore tumorigenicità quando impiantati in topi immunocompromessi: il saggio mammosphere è diventato anche ampiamente utilizzato per la sua capacità di identificare in modo retrospettivo Sfera d' formando cellule che si sviluppano da cloni di cellule simil-staminali singolo. Qui descriviamo approcci per la coltura appropriato di mammospheres da linee cellulari o campioni elementari di pazienti, la loro passaging, e calcoli per stimare sfera fefficienza orming (SFE). Prima discutiamo considerazioni chiave e le insidie della pianificazione e l'interpretazione degli esperimenti mammosphere appropriata.
Introduzione
L'esistenza di linee cellulari tumorali guidati da cellule staminali tumorali staminali come ha notevolmente aggiunto alla nostra comprensione del tumore eterogeneità. Mentre alcuni diversità fenotipica nei tumori si pone dalla conseguenza clonale di cloni geneticamente distinte, una componente importante sembra essere il risultato di differenze epigenetiche: le cellule tumorali possono passare (a volte in modo reversibile) tra stelo, progenitore, e gli stati differenziati attraverso l'attivazione o la repressione di specifici geni programmi di espressione 1 - 3. Questo può riflettere cellulari fattori intrinseci o estrinseci, riflettendo il progra....
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Protocollo
Le procedure di seguito sono stati eticamente approvati dal Imperial College di Londra.
1. Generazione di mammospheres primarie di Human Breast Cancer Cell Lines
NOTA: eseguire le seguenti operazioni sotto una cappa cultura sterile.
- Preparare Mammosphere media contenente DMEM / F12 integrato con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 U / ml di streptomicina. Preparare completo supporto al momento dell'uso con l'aggiunta di 20 ng ml ricombinante fattore / di crescita epidermico umano (EGF, Sigma), 10 ng / ml ricombinante di base del fattore di crescita dei fibroblasti umani (bFGF; ....
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Risultati
Diversi campioni o quelli sottoposti a trattamenti diversi possono variare nel numero di mammospheres> 40 micron che formano dopo normalizzazione per celle iniziali seminate. Calcola mammosphere formando efficienza (MFE) per ogni trattamento cresciuto in triplice copia. Ciò consente esperimenti con diverse densità di semina da confrontare. I dati sono migliori visualizzata su un grafico a barre, idealmente con controlli positivi e negativi, e la visualizzazione della deviazione standard di tutti i pozzetti in triplic.......
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Discussione
La valutazione di successo di mammospheres primarie e secondarie si basa su cellule in fase placcato in sufficientemente basse densità che mammospheres forma da singoli cloni, con un minimo di aggregazione sfera. Tuttavia a densità che sono troppo bassi, troppo pochi mammospheres possono formare per distinguere gli effetti dei trattamenti statisticamente. Densità di semina deve essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare utilizzata dal momento che possono variare notevolmente in loro efficienza sfera formando (color.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi che possa essere percepito come pregiudizievole per l'imparzialità di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal BRC Imperiale, l'Istituto Nazionale per la Ricerca Sanitaria, e lotta contro il cancro, con menzione speciale per Craft Hilary e Sir Douglas Myers.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutammina | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillina & Streptomicina | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinanti (bFGF) | R& D systems | 233-FB-025 | |
| 1x integratore di B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0,5% tripsina/0,2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Siero fetale di vitello | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Piastre a 6 pozzetti a basso attacco | Corning | CLS3814 | |
| Collagenasi tipo 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Ialuronidasi | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Lamette da barba sterili | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Bisturi sterile | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Microdissezione sterile forbici | Sigma Aldrich | S3146 |
Riferimenti
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible format....
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Ristampe e permessi
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