En enzymatisk metode for å redde stamceller fra Clotted beinmargsprøver
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
Mesenchymale stamceller (MSC) spiller en viktig rolle i regenerativ medisin og tissue engineering. De kan migrere, differensiere i ulike celletyper 1 og innpode, som gjør dem til ideelle kandidater for autologe terapier 2,3. I det siste, kliniske forsøk med MSC for bein og brusk reparasjon, graft versus host sykdom eller hjertesykdom ble lansert fire. Disse MSC kan høstes fra navlestreng eller fettvev, men mest lovende resultater ble oppnådd fra benmarg stamceller 5.
Hoftekammen gjør det mulig å samle en betydelig mengde av benmarg og derfor fungerer som hovedområde for aspirasjon 6. Men kvaliteten på aspirer avtar med økende volum av benmarg trukket tilbake. Mens de første 5 ml av benmargs inneholde MSCer av høy kvalitet, tilbaketrekking av større mengder fører til fortynning av aspireres med perifert blod fROM den svært vascularized bein 7. På grunn av de foreliggende megakaryocytter og blodplater, benmarg aspirater er utsatt for koagulering, med mindre antikoagulanter er brukt. Men selv med antikoagulasjonsmidler, kan det oppstå klumper.
I benmargen, MSC representerer bare en liten andel av den totale celle basseng 8 og må utvides i kultur for de fleste tissue engineering eller terapeutiske anvendelser 4. Kvaliteten på en slik kultur, avhenger i stor grad på den første cellen basseng, ie., Mangfold og et høyt startnummer 9. Lavt antall MSC fra uttak kan delvis forklares med donor variabilitet. På den annen side, MSC fra kvalitetsprøver lave krever lengre tid i kultur og utvidet aging å nå ønsket antall celler. I begge tilfeller er forlenget aging en kilde til celle senescens og kan føre til tap av differensiering potensial 10. Derfor optimalisert protokoller som kan maksimere celle yield og hindre skadevirkninger må utvikles 11,12.
Da vi begynte å jobbe med canine MSC, var vi forbauset over å se at omtrent tre av fire hjørnetann beinmargsprøver inneholdt klumper, mens heldigvis klumpete humane prøver (en av ti) var mindre hyppig. På den annen side var det ingen overraskelse at vi observert mye lavere avkastning av MSC fra koagulerte prøver. Å løse den tilbakevendende spørsmålet om koagulerte prøver vi utviklet protokollen med trombolytisk medikament urokinase stedet for resampling.
Trombolytiske behandling kan motvirke livstruende situasjoner som okklusjon av blodårer forårsaker hjerteinfarkt, hjerneslag eller embolisms grunn av uønsket blodpropp. De virker ved nedbrytning av blodpropp gjennom enzymatisk spalting av fibrin av plasmin og enzymatisk plasminogenaktivatorer. Til tross for den utstrakte bruken for behandling av pasienter, bare svært få publikasjoner eksisterer at utnyttet trombolytiske aktiviteterfor laboratoriebruk å redde koagulerte prøver, for det meste fokus på lymfocytter. I 1987 Niku et al. beskrev bruk av streptokinase for å løse opp blodpropper som resulterer i funksjonelle lymfocytter 13 og fire år senere, De Vis et al. utvidet bruk av streptokinase for å isolere leukemiceller fra blod og benmarg for strømningscytometriske anvendelser 14. Antyder En nyere publikasjon bruk av Alteplase for kreftdiagnostikk 15. Mens du bruker den samme enzymatisk tilnærming, fokuserer vår protokoll om isolering av multipotent MSC skjema benmarg for å gi et verktøy for forskere på stamcellefeltet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rutinemessig vi prøve benmarg mens pasienten gjennomgår kirurgi (i vårt tilfelle hovedsakelig ryggraden kirurgi), med den fordelen at bare litt ekstra arbeid må utføres av personell i operasjonen teater. Selv om prøvene blandes med natriumcitrat umiddelbart etter tilbaketrekning, mange prøver var delvis koagulert når de kom i laboratoriet for behandling. På dette stadium vil resampling å erstatte koagulerte prøvene være en separat ekstra inngrep nødvendiggjør igjen lokal eller generell anestesi 6.</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Riferimenti
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
