Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células 1 e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos 2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados 4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais 5.
A crista ilíaca permite recolher uma quantidade considerável de medula óssea e, portanto, serve como local principal de aspiração 6. No entanto, a qualidade do aspirado diminui com o aumento de volume de medula óssea retirada. Enquanto os primeiros 5 ml de aspirado de medula óssea conter MSCs de alta qualidade, a retirada de volumes maiores leva a diluição do aspirado com sangue periférico fesde o osso altamente vascularizado 7. Devido às actuais megacariócitos e plaquetas, aspirados de medula óssea são propensas a coagulação, a menos que sejam utilizados anticoagulantes. Mas, mesmo com anticoagulantes, pode ocorrer a formação de coágulos.
Na medula óssea, as MSCs constituem apenas uma pequena proporção do conjunto total de 8 células e têm de ser expandidas em cultura para engenharia de tecidos ou mais aplicações terapêuticas 4. A qualidade de uma tal cultura depende em grande parte do conjunto de células inicial, isto é., A diversidade e um elevado número de partida 9. Baixo número de MSCs de levantamentos pode ser parcialmente explicado pela variabilidade dos doadores. Por outro lado, as MSCs a partir de amostras de baixa qualidade requerem mais tempo em cultura e passagem em estendida para atingir o número desejado de células. Em ambos os casos, passaging estendido é uma fonte de senescência celular e pode levar à perda de potencial de diferenciação 10. Portanto, os protocolos que podem maximizar celular y otimizadoield e prevenir contra os efeitos prejudiciais têm de ser desenvolvidas 11,12.
Quando começamos a trabalhar com MSCs caninos, ficamos surpresos ao ver que cerca de três em cada quatro amostras de medula óssea de cães contido coágulos, enquanto amostras humanas felizmente coagulado (uma em cada dez) foram menos freqüentes. Por outro lado não foi nenhuma surpresa, observou-se que os rendimentos muito mais baixos de MSCs a partir de amostras coaguladas. Para resolver o problema recorrente de amostras coaguladas, que desenvolveu o protocolo usando o urokinase droga trombolítica em vez de reamostragem.
Terapias trombolíticos pode neutralizar situações que ameaçam a vida, como a oclusão de vasos sanguíneos, provocando um ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou embolia devido a coagulação indesejada. Eles trabalham por degradação dos coágulos através da clivagem enzimática da fibrina pela plasmina e enzimática do plasminogênio ativadores. Apesar da ampla utilização para o tratamento de pacientes, apenas muito poucas publicações que existem atividades trombolíticos utilizadopara aplicações de laboratório para resgatar amostras coaguladas, focando principalmente nos linfócitos. Em 1987, Niku et al. descreveram o uso de estreptoquinase para dissolver coágulos de sangue, resultando em linfócitos funcionais 13 e quatro anos mais tarde, De Vis et al. estendeu o uso de estreptoquinase para isolar as células de leucemia de sangue e medula óssea para aplicações de citometria de fluxo 14. A publicação mais recente sugere o uso de Alteplase para diagnóstico de câncer 15. Enquanto estiver usando a mesma abordagem enzimática, nosso protocolo incide sobre o isolamento de multipotentes da medula óssea MSCs forma a fornecer uma ferramenta para os pesquisadores da área de células-tronco.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma interven?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Riferimenti
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