Le cellule staminali mesenchimali sono solitamente ottenute dal midollo osseo e richiedono una coltura di espansione. Quando i campioni coagulano prima dell'elaborazione, è possibile applicare un protocollo che utilizza il farmaco trombolitico (enzimatico) urochinasi per degradare il coagulo. In questo modo, le cellule vengono rilasciate e disponibili per la coltura di espansione. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento.
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Articolo metodologico
Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) - solitamente ottenute dal midollo osseo - richiedono spesso una coltura di espansione. Il nostro protocollo utilizza l'urochinasi di grado clinico per degradare i coaguli nel midollo osseo e rilasciare MSC per un ulteriore utilizzo. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento del midollo osseo. Il midollo osseo è una delle principali fonti di MSC, che sono interessanti per l'ingegneria tissutale e le terapie con cellule staminali autologhe. Dopo la sospensione, il midollo osseo può coagulare, poiché comprende tutto il sistema ematopoietico. I coaguli risultanti contengono anche MSC che vengono perse per la coltura di espansione o la terapia diretta con cellule staminali. Abbiamo sperimentato che il 74% dei campioni di midollo osseo canino conteneva coaguli e produceva meno della metà del numero di cellule staminali previsto dai campioni non coagulati. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per la digestione enzimatica di quei coaguli per evitare il ricampionamento del midollo osseo intenso e costoso. L'urochinasi, un farmaco trombolitico clinicamente approvato e prontamente disponibile, elimina quasi completamente i coaguli del midollo osseo. Di conseguenza, gli aspirati di midollo osseo trattati producono un numero di MSC simile a quello dei campioni non coagulati. Inoltre, dopo il trattamento con urochinasi, le cellule hanno mantenuto la loro attività metabolica e la capacità di differenziarsi in linee condrogeniche, osteogeniche e adipogeniche. Il nostro protocollo recupera campioni di sangue coagulato e midollo osseo senza compromettere la qualità delle cellule. Questo ricampionamento obsoleto, riduce notevolmente i costi di campionamento e consente l'uso di campioni coagulati per la ricerca o la terapia.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell'ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule 1 e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe 2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati 4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate 5....
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Protocollo
NOTA: aspirati di midollo osseo umano dalla cresta iliaca sono stati raccolti da donatori consenzienti, con l'approvazione del comitato etico del cantone di Lucerna. Canine aspirati di midollo osseo da cresta iliaca sono stati raccolti con consent.Human del proprietario del cane (circa. 20 ml) e canino (circa. 10 ml) aspirati di midollo osseo erano anti-coagulato per aggiunta di 15 ml di 3,8% di citrato di sodio immediatamente dopo la sospensione in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti al ambiente di laboratorio per la lavorazione lo stesso giorno ritirata.
1. Preparazione di Urokinase (Prima del 1 ° Use)
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Risultati
I fatti che il 74% dei campioni di midollo osseo canino (n = 54) conteneva coaguli quando sono arrivati nel nostro laboratorio (Figura 1A) insieme con diminuzione dei rendimenti MSC da questi campioni, ci ha fatto credere che un numero considerevole di MSC era intrappolato all'interno dei coaguli . Infatti, un semplice DAPI-macchia di materiale coagulo sezionata conferma la presenza di cellule nucleate in alta densità (Figura 1B). Questo conduce infine a un basso numero di cellule.......
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Discussione
Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati in laboratorio per l'elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni coag.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale Svizzera Grant CR3I3_140717/1 e dalla Fondazione Svizzera per Paraplegici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| medi basali | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| umano FGF-base | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha con nucleoside, con glutammina stabile | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Amimed inattivato a caldo | 2-01F36-I | ||
| Amfotericina B | Applichem | A1907 | |
| medi adipogenici | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| Siero di coniglio | Gibco | 16120099 | |
| Desametasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| Biotina | Sigma | B4639 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 | |
| Pantotenato | Sigma | P5155 | |
| Olio Rosso-O | Sigma | O0625 | |
| Componenti medi osteogenici Acido | |||
| L-ascorbico 2-fosfato | Sigma | A8960 | |
| ß-glicerofosfato | Sigma | G9422 | |
| Nitrato d'argento (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Componenti | |||
| Biopad - dispositivo medico a forma di spugna | Euroresearch | ||
| L-prolina | Sigma | P5607 | |
| Insulina-Transferrina-Selenio X | Gibco | 51500056 | |
| Fattore di crescita trasformante umano-β 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nucleare veloce rosso | Sigma | N8002 | |
| Generico | |||
| Tri-Sodium citrato diidrato | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urochinasi | Medac | 1976826 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Colorazione di Giemsa | Applichem | A0885 | |
| Formaldeide | Applichem | A0877 | |
| Acido solforico (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| Guanidina cloridrato | Applichem | A1499 | |
| Materiali di consumo Provetta | |||
| reazione da 50 ml | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| Siringa da 10 ml | Braun | 4606108V | |
| Ago Sterican (22G) | Braun | 4657624 | |
| Microprovette da 1,7 ml | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ filtro cellulare m | Falcon | 6.05935 | |
| pinza sterile | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| bisturi sterile | Braun | 5518059 | |
| Primaria piatto di coltura cellulare | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| pallone per colture cellulari - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Attrezzatura | |||
| Cabina di biosicurezza microbiologica classe II | Skan | 82011500 | |
| bagnomaria | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Pipetta sierologica 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| microscopio | Olympus | CKX41 | |
| incubatore umidificato Heracells 240 | Thermo 51026331 | ||
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
Riferimenti
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., e....
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Ristampe e permessi
