Analyse af kontraktile egenskaber kemisk flået eller permeabiliserede, skelet muskelfibre tilbyder en kraftfuld middel til at vurdere muskelfunktion på niveau med det indre muskel celle. I denne artikel vil vi skitsere en gyldig og pålidelig teknik til at forberede og test permeabiliseres skelet muskelfibre in vitro.
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
Den primære funktion af skeletmuskulaturen er at generere kraft. Muskel kraft fremkaldes in vivo gennem en kompleks sekvens af hændelser, der omfatter motor nerve aktionspotentialer, neuromuskulære transmission, muscle fiber aktionspotentialer, frigivelse af intracellulært calcium, og aktivering af systemet med regulerings- og kontraktile proteiner. Fordi force generation er det endelige resultat af denne sekvens, kan et underskud i kraft være forårsaget af svigt i en eller flere af de enkelte trin. Et centralt attribut af permeabiliseret præparat fiber er, at det fjerner de fleste af de trin, der kræves for force generation in vivo, med kun de lovgivningsmæssige og kontraktile funktioner forbundet med myofibrillære apparat tilbage. Investigator forudsætter kontrol over leveringen af aktiverende calcium og energi (ATP), og bliver belønnet med et forenklet system, der tillader vurdering af de isolerede lovgivningsmæssige og kontraktile strukturer i deres oprindelige samarbejdenfiguration. Målinger af kraft ved hjælp af permeabiliserede skelet muskelfibre er således værdifulde, når de vurderer ændringer i muskelfunktion observeret in vivo. For eksempel har vi brugt denne teknik til at karakterisere den kraft produktionskapacitet af fibre fra myostatin mangelfuld mus 1 og vurdere årsagen til vedvarende muskelsvaghed udstillet efter kronisk rotator cuff tårer 2,3.
Moderne permeabiliseret fiber metodik kan spores tilbage til begyndelsen af indflydelsesrige studier 4,5 og er i øjeblikket i brug af en række forskningsgrupper. Selvom teknikker er blevet beskrevet i litteraturen, er de endnu ikke blevet præsenteret i videoformat. Målet med denne artikel er at illustrere en opdateret, gyldig og pålidelig teknik til måling af den maksimale kraft produktionskapacitet af enkelte fibre fra kemisk permeabiliserede skeletmuskulaturen prøver. For at opnå dette, en individuel fiber segment (henvist til heri som en ̶0; fiber ") er udvundet fra en præ-permeabiliseres bundt af fibre og anbringes i en eksperimentel kammer, der indeholder en afslappende løsning, det afgørende træk, som er en calciumkoncentration, der er <10 nM. Fiberen bliver derefter fastgjort ved den ene ende til en kraft-transducer og ved den anden ende til en længde-controller. Med fiberen holdes i en optimal sarkomer længde, overføres det til en aktiverende opløsning, der har en calciumkoncentration tilstrækkelig til at fremkalde maksimal aktivering og dermed maksimal isometrisk kontraktion kraft. Force data erhverves, opbevares og analyseres ved hjælp af en personlig computer.
Vurderinger af de kontraktile egenskaber af permeabiliserede enkelt skeletmuskel fibre anvendes til at undersøge muskelfunktionen hos en lang række forskellige sammenhænge. Eksempler omfatter undersøgelser, der har evalueret effekten af aldring 12, udøve 10,13,14, rumflyvning 15, skade 2,3,16, narkotika behandlinger 17,18, sygdom 19 og genetisk manipulation 20,21 om fiber struktur og funktion. På grund af evnen til direkte at vurdere den kontraktile udførelsen af myofibriller i deres native konfiguration, denne teknik giver en attraktiv platform at danne en forståelse af myofibrillar funktion fraværende af potentielt forstyrrende effekter, der er til stede, når neuromuskulær signaltransmission og excitation-induceret calciumfrigivelse er inkluderet i systemet, der undersøges. Desuden kan funktionel test af enkelte fibre anvendes til at supplere kontraktile proteinidentifikation resultater som demopnået ved immunhistokemi eller gelelektroforese + western blot 22.
En af de primære funktioner af skeletmuskler er at generere kraft. Følgelig sF o, et mål for den iboende kraft generere kapacitet af et kontraktile system er af stor interesse for muskel fysiologer. Pålidelige skøn SF o kræver præcise målinger af både fiber CSA og F o. Da fibre er generelt hverken cirkulær i tværsnit, og heller ikke ensartet i CSA langs deres længde, skal være meget omhyggelig, når estimering CSA. Til dette formål gennemføres målinger på flere steder langs længden af fiberen, og på hvert sted, fra to perspektiver adskilt af 90 °. Pålidelige målinger af F o kræver opmærksomhed på flere detaljer, herunder tegner sig for passiv kraft, justere sarkomeret længde for at maksimere overlap af tykke og tynde filamenter, ansætte en aktiverende løsning med en calciumkoncentration that resulterer i maksimale aktivering og fastholde den ønskede eksperimentelle temperatur, og opretholde optimale opbevaringsbetingelser (temperatur og varighed) af fibrene før dagen for eksperimentet.
Mens trinene her beskrive proceduren for evaluering af maksimal isometrisk kraft, er det ofte ønskeligt at vurdere andre vigtige funktionelle kvaliteter skelet muskelfibre. Dette kan opnås ved at udvide den eksperimentelle protokol til at omfatte yderligere mekaniske manipulationer af fiberen. For eksempel måling af den hastighed, hvormed fiberen forkorter mod en række forskellige belastninger tillader bestemmelse af den kraft-hastighed forhold, hvorfra kraft-automatisk og hastighed-magtforhold kan beregnes 10,23,24. Derudover kan hastigheden af ubelastet afkortning bestemmes ved anvendelse af den "slæk test" 25, som består af at anvende en serie af slack-inducerende afkortning trin og measuring den tid, som fiberen for at fjerne slækket. En anden kinetiske parameter, der ofte rapporteres, er k tr, hastighedskonstanten for force ombygningen efter en mekanisk forstyrrelse, som midlertidigt løsner alle crossbridges 26. Endelig er forholdet mellem calciumkoncentration og aktiv kraft generation (den "force-PCA forhold") ofte af interesse 18 og kan bestemmes ved at udsætte fiberen til en række opløsninger med calcium koncentrationer i området fra under tærsklen for at aktivere den kontraktile Systemet til dem tilstrækkelig til at fremkalde maksimal aktivering og derfor maksimale kraft (F o).
Om meget af det nævnte udstyr er nødvendig til vurdering enkelt fiber kontraktilitet, andet udstyr er ikke absolut nødvendigt. Længden-controller, for eksempel, er afgørende for enhver eksperimentel protokol, der kræver hurtig eller præcis forlængelse eller afkortning af fiberen,men er ikke absolut nødvendige for at vurdere maksimal isometrisk kraft (selv om en nul-force niveau i kraft rekord stadig skal identificeres ved nogle midler). Prismerne der tillader observation af fiberen fra siden, mens nyttige ved vurdering tværsnitsareal, er ikke absolut nødvendigt for at positionere fiberen i den eksperimentelle kammer. Endvidere alternative midler, for at udsætte fiberen til de forskellige eksperimentelle løsninger kunne anvendes, herunder udtænke en manuelt betjent system med kamre eller et enkelt kammer, der tillader hurtig fyldning og tømning af løsninger. Endelig, mens sub-fysiologiske eksperimentelle temperaturer, såsom 15 ° C almindeligvis anvendes til at forbedre reproducerbarheden af mekaniske målinger 1,2,3,5,8,12,17,27, er det muligt at generere gyldige data ved andre temperaturer 23 , 28 så længe virkningerne af temperaturen på opløsningsegenskaber (calcium-koncentration, pH, etc.) tages i betragtning. </p>
Præparaterne de test løsninger er blandt de mest kritiske aspekter af de permeabiliserede fiber teknikker beskrevet her. Overvejelser om løsning sammensætning er komplekse, og uden for rammerne af denne artikel. De er beskrevet i trin 5 i protokollen sektion løsninger er designet med vægt på hurtig aktivering af permeabiliseret fiber ved overførsel fra præ-aktivering til aktivering løsninger og samtidig opretholde en konstant ionstyrke, kationiske sammensætning, og osmolaritet 6,29. Andre tilgange til løsning sammensætning har været ansat bemærkelsesværdig succes ved andre forskningsgrupper og typisk gør brug af offentliggjorte bindende konstanter og beregningsværktøjer 27,30,31. Koncentrationerne af calciumioner i de forskellige aktiverende opløsninger er særlig vigtig i undersøgelser med submaksimal aktivering såsom kraft-PCA evalueringer. For forsøg, hvor fibrene er fuldt aktiveret, såsom de beskriverd her, koncentrationen calcium i aktiverende løsning typisk overstiger med en komfortabel margen, der kræves for at opnå maksimal kraft, hvilket gør den præcise viden mindre kritisk. Tilsætning af creatinphosphat er vigtig for buffering de intramyofibrillar ATP og ADP udsving, der ellers ville være forbundet med kontraktil aktivitet. Kreatinkinase er påkrævet for at katalysere phosphat overførsel fra kreatin phosphat til ADP. Under forsøgsbetingelser, der resulterer i høje ATP omsætningshastigheder, herunder arbejder ved høje temperaturer eller måling højhastighedstog afkortning i hurtige fibre 32, skal kreatinkinase tilsættes til opløsningen for at supplere den endogene kreatinkinase, der forbliver bundet til fiberen. Til mindre krævende eksperimentelle betingelser, ATP regenerering system er mindre kritisk 27.
Begrænsninger af permeabiliserede enkelt fiber teknik omfatter følgende. De data, der genereres af disse tests definererkontraktile egenskaber af den specifikke myofibrillære enhed, der var knyttet til den eksperimentelle apparatur. Derfor er dette indfanger kun en lille brøkdel af hele flercellede fiber fra hvilken segmentet blev opnået som på sin side udgør en lille brøkdel af det samlede antal fibre i musklen. Efterforskere bør derfor nøje overveje prøveudtagninger, som kræves for at støtte nogen konklusioner eksperimenterne. Derudover evaluere virkningen af en øvelse træning intervention fiber funktion forudsætter, at de evaluerede fibre faktisk blev rekrutteret i løbet af uddannelsen. Selvom protokollen forsøger at efterligne den naturlige intracellulære miljø af fiberen, sarcolemma permeabilisering processen er ikke-specifik og nødvendigvis giver opløselige intracellulære bestanddele til frit diffundere ind i badning løsninger. En yderligere konsekvens af membranens permeabilitet er en ændring i den osmotiske balance fremgår af en hævelse i fibervolumen 33. Denfiber hævelse øger afstanden mellem actin og myosin filamenter som medfører reduceret calcium følsomhed af myofilament systemet 34,35, men kan vendes ved indførelse af store, osmotisk aktive forbindelser 34. En sidste begrænsning at overveje, er en følge af den teknik, der anvendes til at fastgøre fibrene til den eksperimentelle enheder. Det kræver uvægerligt forvrider rumlige forhold i glødetråden system på og i nærheden af fastgørelsespunkterne, med at deltage funktionelle underskud. Specifikt regioner i fiberen ved og støder op til fastgørelsespunkterne funktionelt kompromitteret og dermed bidrage kunstig serie elasticitet til målesystemet.
Sammenfattende har vi beskrevet et middel til at vurdere den kraft-produktionskapacitet af kemisk permeabiliserede skeletmuskulatur fibre in vitro. Selvom fokus i denne artikel har været på vurderingen af maksimal isometrisk kraft generating kapacitet af humane skelet muskelfibre, kan den eksperimentelle tilgang ændres og udvides til at bestemme en række kinetiske parametre og relationer på tværs af en række arter, pattedyr eller på anden måde.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
LabVIEW software | National Instruments | – | |
Computer | Varied | – | |
Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
Reagents | |||
K-proprionate | TCI America | P0510 | |
Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |