HPLC Meting van de DNA oxidatie Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, in celcultuur en dierlijke weefsels
Summary
Het doel van dit protocol is de detectie van de merker DNA oxidatie, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) HPLC-ED, in DNA van gekweekte cellen of dierlijke weefsels.
Abstract
Oxidatieve stress is geassocieerd met vele fysiologische en pathologische processen, alsmede xenobiotische metabolisme, wat leidt tot de oxidatie van biomacromoleculen, zoals DNA. Daarom efficiënte detectie van DNA oxidatie is belangrijk voor verschillende onderzoeksdisciplines, inclusief medicijnen en toxicologie. Een gemeenschappelijke biomarker oxidatief beschadigde DNA 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; vaak verkeerd aangeduid als 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo of 8 oxo-dG)). Verschillende protocollen voor 8-oxo-dGuo meting door hogedruk vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-ED) zijn beschreven. Deze werden echter voornamelijk toegepast op gezuiverde DNA behandeld met pro-oxidanten. Bovendien vanwege methodologische verschillen tussen laboratoria, voornamelijk vanwege het verschil in de analytische apparatuur, de toepassing van gepubliceerde werkwijzen voor detectie van 8-oxo-dGuo HPLC-ED vereist een zorgvuldige optimalisatie door elk laboratorium. EENuitgebreide protocol, beschrijft een dergelijk optimalisatieproces, ontbreekt. Hier, wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de detectie van 8-oxo-dGuo door HPLC-ED, in DNA van gekweekte cellen of dierlijke weefsels. Het illustreert hoe DNA monstervoorbereiding gemakkelijk en snel kan worden geoptimaliseerd om ongewenste DNA oxidatie die kunnen optreden tijdens monsterbereiding te minimaliseren. Dit protocol toont hoe 8-oxo-dGuo detecteren in gekweekte humane alveolaire adenocarcinoma cellen (bijv A549 cellen) behandeld met het oxidatiemiddel KBrO 3, en de milt van muizen die zijn blootgesteld aan de polycyclische aromatische koolwaterstoffen dibenzo (def, p) chryseen (DBC, voorheen bekend als dibenzo (a, l) pyreen, DalP). Kortom, dit werk illustreert hoe een HPLC-methode ED gemakkelijk kan worden geoptimaliseerd voor de detectie van 8-oxo-dGuo in biologische monsters.
Introduction
Reactive oxygen species (ROS), waarvan de steady-state niveaus kunnen verhogen gedurende vele pathologische condities en xenotoxic metabolisme, bijdragen aan een verhoogde frequentie van oxidatieve DNA-schade. Onder verschillende mogelijke nucleobasen oxidatieproducten, oxidatieve DNA schade gemakkelijk worden gemeten met de stabiele merker 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo), die een van de geoxideerde vormen van 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo is het meest voorkomende DNA-laesie 2 en daarom is bestudeerd om meer detail als een DNA oxidatie biomarker ondanks het bestaan van meerdere DNA oxidatieproducten 3. Bij de mens, kan deze schade via base excisie reparatie worden gerepareerd door 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Indien verlaten unrepaired, kan 8-oxo-dGuo bijdragen tot de vorming van basenparen-substitutie mutaties (bijv G tot transversies T) 4. Belangrijk, 8-oxo-dGuo is een gevestigde marker for DNA schade in verband met de initiatie en promotie van kanker 2. Daarom kwantificatie van 8-oxo-dGuo is een nuttig en wenselijk biomarker van oxidatieve DNA schade 5.
Algemeen wordt verwarring in de literatuur met betrekking tot de juiste namen voor oxidatief beschadigde vormen van 2-deoxyguanosine en bovendien de correcte naam van de verbinding (en) routinematig gemeten als een biomarker van oxidatieve DNA schade 6. De 6,8-diketo en 6-enol, 8-keto tautomere vormen van 8-oxo-dGuo (figuur 1) zijn de twee belangrijkste tautomeren besproken in de literatuur 5,7. De 6,8-diketo vorm is de belangrijkste vorm bij fysiologische pH van 7,4 en het meest prominente DNA-oxidatieproduct 7. Derhalve 8-oxo-dGuo plaats van 8-hydroxy-dGuo het meest geschikte naam voor dit oxidatieproduct 6. Het is ook belangrijk dat 2-deoxyguanosine (dGuo) op, in plaats nucleobase guanine (Gua) of ribonucleoside guanosine (Guo) respectievelijk gedetecteerd door de meeste methoden 6.
Nauwkeurige detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo is uitdaging omdat: i) variabiliteit in de digestie van het DNA-monster, ii) oxidatie van onvoorziene dGuo tot 8-oxo-dGuo die kunnen optreden tijdens de voorbehandeling, en iii) de behoefte voor een effectieve validatie van de analytische HPLC-ED-methode 8. In dit protocol, we gericht op i) het verschaffen van omstandigheden, die gunstig zijn voor volledige DNA digestie en ii) Door de opneming metaalchelator en chelator behandelde oplossingen en een speciale-DNA isoleren reagens, terwijl iii) slechts gedeeltelijk door het opnemen van geadresseerde positieve controles en waardoor de werkwijze kunnen worden gedetecteerd 8-oxo-dGuo in biologische monsters. Verdere validatie is buiten het bestek van dit artikel. Maar we zijn ervan overtuigd dat dit protocol zal helpen de aspirant-gebruikers bepalen de mate waarin zij nodig hebben om formeel te valideren van het protocol, afhankelijk van hun doelen. Een lijst met te doen voor de formele validatie van de werkwijze wordt verder verschaft. Tijdens de ontwikkeling en implementatie van een methode voor het 8-oxo-dGuo detectie, werden gepubliceerd methoden beoordeeld en geconsolideerd. Dus, deze methode elimineert de noodzaak om informatie te verzamelen uit verschillende gepubliceerde bronnen die vaak ontbreken belangrijke experimentele details, terwijl ook het verstrekken van een snelle en ongecompliceerde manier van testen als de methode voor de detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo met succes is aangenomen. Deze aangepaste methode werd gebruikt om DNA-monsters met succes analyseren van gekweekte cellen en muizen weefsel. Deze video levert andere groepen bij de vaststelling van een effectieve methode voor betrouwbare detectie en kwantificering van 8-oxo-dGuo HPLC-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de 8-oxo-dGuo is gerapporteerd als nuttig biomarker van DNA oxidatie, kan de betrouwbare kwantificering uitdaging vormen. Hoewel een aantal gepubliceerde methoden bestaan, is er behoefte aan een alomvattend, beschrijvende overzicht protocol voor onderzoekers mogelijk de werkwijze in het laboratorium te zetten. Hier presenteren we een gedetailleerd overzicht van een HPLC-gebaseerd protocol dat nieuwe gebruikers toe om een effectieve werkwijze voor 8-oxo-dGuo detectie en kwantificering stellen.
<p class="…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Health Canada Genomics Research en Development Initiative (GRDI) en de Canadese regelgeving strategie voor Biotechnologie (CRSB). De auteurs hebben geen belangenconflict.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
Riferimenti
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
