HPLC: Mesure de l'oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux
Summary
Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l'oxydation de l'ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.
Abstract
Le stress oxydatif est associé à de nombreux processus physiologiques et pathologiques, ainsi que le métabolisme des xénobiotiques, conduisant à l'oxydation des macromolécules biologiques, y compris l'ADN. Par conséquent, la détection efficace de l'oxydation de l'ADN est important pour une variété de disciplines de recherche, y compris la médecine et de la toxicologie. Un biomarqueur commun par oxydation de l'ADN endommagé est le 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo; souvent appelée à tort comme 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine (8-OH-dGuo ou 8 oxo-dG)). Plusieurs protocoles de mesure 8-oxo-dGuo par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-ED) ont été décrites. Toutefois, ceux-ci ont été principalement appliquées à l'ADN purifié traité avec pro-oxydants. En outre, en raison de différences méthodologiques entre les laboratoires, principalement en raison de différences dans l'équipement analytique, l'adoption de méthodes publiées pour la détection de la 8-oxo-dGuo par HPLC-ED nécessite une optimisation soignée par chaque laboratoire. UNprotocole complet, décrivant un tel processus d'optimisation, est absente. Ici, un protocole détaillé est décrit pour la détection de 8-oxo-dGuo par HPLC-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux. Elle illustre comment la préparation d'échantillons d'ADN peut être facilement et rapidement optimisée pour minimiser l'oxydation indésirable de l'ADN qui peut se produire au cours de la préparation des échantillons. Ce protocole montre comment détecter 8-oxo-dGuo dans des cellules humaines en culture d'adénocarcinome alvéolaire (par exemple, des cellules A549) traités avec l'agent oxydant KBrO 3, et à partir de la rate des souris exposées à la dibenzo d'hydrocarbure aromatique polycyclique (DEF, p) chrysène (DBC, anciennement connu sous le dibenzo (a, l) pyrène, Dalp). Dans l'ensemble, ce travail illustre comment une méthode HPLC-ED peut être facilement optimisée pour la détection de la 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques.
Introduction
Espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont les niveaux de l'état d'équilibre peut augmenter pendant de nombreuses conditions pathologiques et le métabolisme xenotoxic, contribuent à une augmentation de la fréquence des dommages oxydatifs à l'ADN. Parmi plusieurs produits d'oxydation possibles de nucléobases, des dommages oxydatifs de l'ADN peut être facilement mesurée en utilisant le marqueur stable 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo), qui est l'une des formes oxydées de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ADN est le plus abondant lésion 2 et, par conséquent, a été étudiée de façon plus détaillée en tant que biomarqueur de l'oxydation de l'ADN malgré l'existence de produits d'oxydation de l'ADN multiple 3. Chez l'homme, ces dommages peuvent être réparé via la base réparation par excision de 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Si laissé non réparés, 8-oxo-dGuo peut contribuer à la formation de base de mutations paire de substitution (ie, G à T transversions) 4. Fait important, la 8-oxo-dGuo est un marqueur établi for dommages à l'ADN par rapport à l'initiation et à la promotion de la cancérogenèse 2. Par conséquent, la quantification précise de la 8-oxo-dGuo est un biomarqueur utile et souhaitable de dommages oxydatifs de l'ADN 5.
Il ya une grande confusion dans la littérature concernant les noms corrects pour les formes oxydante endommagées de 2-désoxyguanosine et, d'ailleurs, le nom correct du composé (s) régulièrement mesurés en tant que biomarqueur de lésions oxydatives de l'ADN 6. Les 8-céto-6,8-dicéto-énol et 6, les formes tautomères des 8-oxo-dGuo (représenté sur la figure 1) sont les deux plus importants tautomères décrits dans la littérature 5,7. La forme 6,8-dicéto est la forme la plus importante au pH physiologique de 7,4, et est le produit d'oxydation de l'ADN le plus important 7. Par conséquent, 8-oxo-dGuo, plutôt que 8-hydroxy-dGuo est le nom le plus approprié pour ce produit d'oxydation 6. Il est également important de noter que le 2-désoxyguanosine (dGuo), plutôt que nucleobase guanine (GUA) ribonucléoside ou guanosine (Guo), respectivement, sont détectés par la plupart des méthodes 6.
Détection précise et la quantification de 8-oxo-dGuo est difficile en raison de: i) la variabilité dans la digestion de l'échantillon d'ADN, ii) l'oxydation accidentelle de dGuo à 8-oxo-dGuo qui peut se produire lors de la préparation de l'échantillon, et iii) la nécessité pour la validation effective de la méthode HPLC-ED analytique 8. Dans ce protocole, nous avons cherché à obtenir i) en fournissant des conditions, favorables à la digestion complète de l'ADN et ii) par le chélateur inclusion de métal et des solutions de chélateur-traitée et un réactif d'ADN isolation spéciale, tandis que iii) n'a été que partiellement abordées par l'inclusion de Des témoins positifs et fournissent ainsi que la méthode est capable de détecter des 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. En outre la validation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, nous sommes convaincus que ce protocole aidera la prospectiveles utilisateurs à déterminer la mesure dans laquelle ils ont besoin de valider formellement le protocole, en fonction de leurs besoins. Une liste des étapes nécessaires à la validation formelle de la méthode est fournie plus loin. Pendant le développement et le déploiement d'une méthode de détection 8-oxo-dGuo, méthodes publiées ont été revues et consolidées. Ainsi, cette méthode élimine le besoin de recueillir des informations de plusieurs sources publiées qui manquent souvent d'importants détails expérimentaux tout en fournissant également des moyens rapides et simples de tester si la méthode pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo a été adoptée avec succès. Ce procédé a été adapté avec succès utilisé pour analyser des échantillons d'ADN à partir de cellules en culture et le tissu murin. Cet article vidéo aidera les autres groupes à établir une méthode efficace pour la détection et la quantification fiable de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que 8-oxo-dGuo a été rapporté comme un biomarqueur utile de l'oxydation de l'ADN, sa quantification fiable peut représenter un défi. Bien que plusieurs méthodes publiées existent, il ya une nécessité d'une approche globale, aperçu descriptif du protocole pour permettre aux chercheurs de déployer la méthode dans leurs laboratoires. Ici, nous présentons un aperçu détaillé d'un protocole fondé HPLC-qui permettra aux nouveaux utilisateurs d'établir une méthode efficace pour …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l'Initiative de Santé Canada de recherche en génomique et le développement (GRDI) et la Stratégie canadienne de réglementation de la biotechnologie (SCRB). Les auteurs ne sont pas de conflit d'intérêts.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
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