HPLC Måling av DNA Oksidasjon Biomarker, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin, i dyrkede celler og dyrevev
Summary
Målet med denne protokollen er deteksjon av DNA oksydasjon markør, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo) ved hjelp av HPLC-ED, i DNA fra dyrkede celler eller animalsk vev.
Abstract
Oksidativt stress er forbundet med mange fysiologiske og patologiske prosesser, samt xenobiotisk metabolisme, som fører til oksidasjon av biomacromolecules, inkludert DNA. Derfor er effektiv påvisning av DNA oksydasjon viktig for en rekke forskningsdisipliner, inkludert medisin og toksikologi. En vanlig biomarkør av oksydativt skadet DNA er 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo, ofte feilaktig referert til som 8-hydroksy-2'-deoksyguanosin (8-OH-dGuo eller 8 -okso-dG)). Flere protokoller for 8-oxo-dGuo måling ved høytrykks-væskekromatografi med elektrokjemisk deteksjon (HPLC-ED) er blitt beskrevet. Men disse ble hovedsakelig brukt til renset DNA behandlet med pro-oksidanter. I tillegg, på grunn av metodiske forskjeller mellom laboratorier, hovedsakelig på grunn av forskjeller i analyseutstyr, bruk av publiserte metoder for påvisning av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED krever forsiktig optimalisering av hvert laboratorium. Amangler omfattende protokoll, som beskriver en slik optimaliseringsprosess,. Her er en detaljert protokoll som er beskrevet for deteksjon av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED, i DNA fra dyrkede celler eller animalsk vev. Det illustrerer hvordan DNA prøveopparbeidelse kan enkelt og raskt optimalisert for å minimalisere uønsket DNA oksidering som kan oppstå under tillagingen. Denne protokollen viser hvordan oppdage 8-oxo-dGuo i dyrkede humane alveolare adenokarsinomceller (dvs. A549-celler) ble behandlet med oksydasjonsmiddel KBrO 3, og fra milten av mus eksponert for den polycykliske aromatiske hydrokarbon dibenzo (def, s) chrysen (DBC, tidligere kjent som dibenzo (a, l) pyren, DalP). Totalt, illustrerer dette arbeidet hvordan en HPLC-ED metode kan lett optimaliseres for påvisning av 8-oxo-dGuo i biologiske prøver.
Introduction
Reaktive oksygenforbindelser (ROS), hvis steady-state nivåer kan øke i mange patologiske tilstander og xenotoxic metabolisme, bidrar til en økt frekvens av oksidativ DNA skade. Blant flere mulige nukleobaser oksydasjonsprodukter, kan oksidativt DNA-skade lett kan måles ved hjelp av den stabile markør 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo), som er en av de oksyderte former av 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo er den mest tallrike DNA lesjon 2 og har derfor blitt studert i større detalj som en DNA-oksidasjon biomarkør tross for eksistensen av multiple DNA-oksidasjonsprodukter tre. Hos mennesker kan denne skaden repareres via basen excision reparasjon av 8-oxoguanine glykosylase 1 (hOGG1) 4. Hvis venstre ureparert, kan 8-oxo-dGuo bidra til dannelsen av basepar-substitusjons mutasjoner (dvs. G til T transversions) 4. Viktigere er 8-oxo-dGuo en etablert markør for DNA-skader i forhold til initiering og markedsføring av carcinogenesis to. Derfor er nøyaktig kvantifisering av 8-oxo-dGuo en nyttig og ønskelig biomarkør av oksidativ DNA-skade 5.
Det er utbredt forvirring i litteraturen om de riktige navnene for oksidativt-skadede former av to-deoksyguanosin og dessuten riktig navn på forbindelsen (e) rutinemessig målt som en biomarkør for oksidativ DNA skade 6. De 6,8-diketo-enol og 6, 8-keto tautomere former av 8-oxo-dGuo (vist i figur 1) er de to mest fremtredende tautomerer diskutert i litteraturen 5,7. De 6,8-diketo formen er den mest fremtredende formen ved fysiologisk pH-verdi på 7,4, og er den mest fremtredende DNA oksidasjonsprodukt 7. Derfor, 8-oxo-dGuo, er i stedet for 8-hydroksy-dGuo den mest passende navn for denne oksydasjon produktet 6. Det er også viktig å merke seg at 2-deoksyguanosin (dGuo), heller enn nucleobase guanin (Gua) eller ribonukleosid guanosin (Guo), respektivt, blir detektert ved de fleste metoder 6.
Nøyaktig deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo er utfordrende på grunn av: i) variabiliteten i fordøyelsen av DNA-prøven, ii) adventitious oksydasjon av dGuo til 8-oxo-dGuo som kan oppstå under tillagingen, og iii) behovet for effektiv validering av den analytiske HPLC-metode 8 ED. I denne protokollen, som tar sikte på å oppnå vi i) ved å tilveiebringe betingelser gunstige for fullstendig DNA-fordøyelse og ii) ved å inkludere metallchelator og chelatorkonjugert behandlede løsninger og en spesiell DNA-isolering reagens, mens iii) var bare delvis løses ved å inkludere positive kontroller og dermed gjør at fremgangsmåten er i stand til å detektere 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Ytterligere validering er utenfor omfanget av denne artikkelen. Men vi er sikre på at denne protokollen vil hjelpe potensiellebrukerne bestemme i hvilken grad de trenger for å validere formelt protokollen, avhengig av deres formål. En liste av trinn som kreves for den formelle validering av metoden er gitt videre. Under utvikling og utplassering av en metode for 8-oxo-dGuo påvisning ble publisert metoder gjennomgått og konsolidert. Således eliminerer metoden behovet for å samle informasjon fra flere publiserte kilder som ofte mangler viktige eksperimentelle detaljer samtidig som det gir også enkel og rask metode for testing hvis metoden for deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo er vedtatt måte. Dette tilpasses metoden ble benyttet for å kunne analysere DNA-prøver fra dyrkede celler og murine vev. Denne video artikkelen vil hjelpe til andre grupper i å etablere en effektiv metode for pålitelig deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om 8-oxo-dGuo har blitt rapportert som en nyttig biomarkør av DNA oksidasjon, kan dens pålitelig kvantifisering en utfordring. Selv om flere publiserte metoder eksisterer, er det behov for en omfattende, beskrivende oversikt over protokoll for å tillate forskere å distribuere metoden i deres laboratorier. Her presenterer vi en detaljert oversikt over en HPLC-basert protokoll som vil tillate nye brukere å etablere en effektiv metode for 8-oxo-dGuo deteksjon og kvantifisering.
Tre vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) og den kanadiske Regulatory strategi for bioteknologi (CRSB). Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
Riferimenti
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
