같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em> 체외</em> 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전
Summary
Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.
Abstract
허혈 재관류 (IR)는 부상 허혈성 뇌졸중과 관련된 이환율과 사망율에 크게 기여하는 것으로 알려져있다. 허혈성 뇌 혈관 사고는 모든 뇌졸중의 80 %를 차지한다. IR 부상의 일반적인 원인은 활성 산소의 형성을 유발 조직에 혈액, 영양소, 산소의 급성 / 만성 폐색 다음과 같은 유체의 급속한 유입이다.
허혈성 뇌졸중은 혈액 – 뇌 장벽 (BBB) 부전 vasogenic 뇌부종 따른다. 구조적으로, 혈관 내피 세포 간의 긴밀한 접합 (TJS)은 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)의 무결성을 유지하는데 중요한 역할을한다. IR 부상이 아닌 특정 염증 반응으로 이어지는 초기 보조 부상입니다. 염증 다음 산화 및 신진 대사에 영향을 미치는 스트레스는 BBB 투과성 꽉 접합 (TJ) 무결성의 중단을 포함하여 보조 뇌 손상을 트리거합니다.
우리의 프로토콜은 체외 제공 </ EM> 쥐 뇌 내피 세포 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성에 산소 – 글루코스 손실과 재산 소화 (OGD-R)의 예. 현재 생체 내 모델에서 여러 실험은 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용된다; 그러나 그들은 이러한 기계적인 관계를 공부 수술, 유전자 따라 분자의 영향과 어려움을 수행함에있어 기술적 문제 등 여러 가지 한계를 가지고. 그러나, 체외 모델은 그 많은 한계를 극복하는 데 도움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 잠재적 인 치료 전략을 제공하는 다양한 분자 메커니즘 및 기계적인 관계를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 체외 연구 결과는 생체 내 연구에서 표준과 다를 수 있습니다주의를 해석되어야한다.
Introduction
허혈 재관류 (IR)은 부상 뇌졸중, 심근 경색, 외상, 말초 혈관 질환, 외상성 뇌 손상과 관련된 다양한 1,2- 쇠약 합병증 및 사망의 원인으로 자주 발견된다. 뇌 혈관 IR 부상 염증과 부종 3에 이르는 초기 보조 부상입니다. 산화 및 염증 다음 대사성 스트레스의 결과로서 발생하는 합병증의 하나는 항상성 자유 라디칼 형성에 주요한 균형, 혈액 – 뇌 장벽의 변화 (BBB) 단단한 접합부 (TJS) 및 미세 혈관 투과성 4,5의 손실이다.
현재, BBB에 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용되는 생체 내 모델에서 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) microembolism 및 트랜스 제닉 또는 녹아웃 동물을 포함한다. Hossmann 6 논의 그러나, 각각의 단점과 한계가있다. MCAO 모델은 effec을 연구하는 데 사용됩니다산화 환원 스트레스의 TS, BBB의 접합부 통신의 변화와 뇌와 면역 세포 사이의 상호 작용. 그러나, 이들은 그러한 내부에 정밀한 미세 수술 절차 및 어려움에 대한 요구와 같은 다양한 기술적 과제를 제시한다. 뇌허혈을 연구하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 사용이 경색 형성에 유전자에 의존하는 분자의 영향, 혈관 해부학의 변화와 다양한 체중 (6)과 같은 문제가있을 수 있습니다 동안 Microembolism는 순간적으로 BBB를 분해. 따라서, 허혈의 체외 모델은 의약품에 대한 역학적 연구를 수행하는 그들의 적용에 주로 최근에 관심을 증가 발견했다. 그러나, 시험관 연구의 결과는 완전히 생체 연구를 나타내지 있으므로 취급시주의를 6으로 해석해야합니다.
내피 세포의 단층 및 미세 혈관 투과성이 낮은 산소 농도의 반작용 효과가 있었다오가와 (7)에 의해 연구. 쥐의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (RBMECs)는 체외 BBB을 개발하는데 사용되었다. 이 프로토콜에 제시된 산소 포도당 박탈과 재산 소화 (OGD-R) 기술은 Zulueta 등의 알과 주홍 등 8,9에 의해 연구에서 적용되고있다. 우리는 0 % O 2, 5 % CO 2 및 95 % N 2를 포함하는 저산소증 / 무산소 증 챔버에 넣어서 OGD-R에 뇌 내피 세포를 노출시켰다. 세포는 나중에 각각 면역 현지화 및 로다 민 팔로이 딘 라벨을 사용하여 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성의 변화에 대해 평가 하였다. zonula occludens-1의 (ZO-1)의 면역 형광 염색 ZO-1과 같이, TJ의 무결성을 판단하기 위해 수행된다 TJ 단백질 결합에 중요한 발판 막이다. 로다 민 Phalloidin의 라벨링은 세포 골격의 사상 액틴 수 (F- 액틴)를 결정하고, 내피 세포에서 액틴 스트레스 섬유 형성의 명확한 표시이다.
<P 클래스 = "jove_content는">이 방법의 목적은 BBB 내피 세포 TJ 무결성 및 F 액틴 스트레스 섬유 형성을 연구하기위한 생체 외 IR 모델로서 OGD-R의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것이다. 결과는 TJ 단백질의 운명에 대한 정보를 제공, ZO-1, R-OGD 다음 스트레스 섬유 형성한다. 이러한 관계를 이해하는 것은 OGD-R을 다음 트리거되는 기본 분자 메커니즘을 결정하고 OGD-R 처리 다음 BBB 중단을 향상시키기 위해 잠재적 인 치료 전략을 개발 할 수있는 기회를 제공 할 것입니다.Protocol
Representative Results
Discussion
허혈 – 재관류 손상에 대한 생체 외 모델로 OGD-R은 잘 신경 세포 (10, 11)을 공부 설립되었습니다. 투과도 및 TJ 무결성 9 뇌 내피 세포 및 변경에 OGD의 효과를 나타내는 연구가있다. 그러나, 우리의 연구는 다음과 같은 허혈성 뇌졸중 발생 생체 조건에서 허혈성 재관류 손상에 가까운 표현이다 OGD의 효과뿐만 아니라 재산 소화를 보여줍니다.
저산소 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 재정 지원을 위해 스콧과 백인 병원 연구 보조금 프로그램을 인정하고 텍사스 A & 공 초점 레이저 현미경의 사용에 대한 의학 통합 이미징 연구소의 M 건강 과학 센터 대학. 우리는 원고 편집에 대한 도움말 씨 글렌 Cryer을 인정합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
Riferimenti
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
- Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
- Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).
- Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
- Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
- Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
- Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
- Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
- Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
- Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
- Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
- Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).
