Summary
Vi beskriver her, hvordan du forbereder knogle-medium (BCM) og teste dens aktivitet in vitro.
Abstract
Autologe knogletransplantater er meget udbredt i oral og maxillofacial kirurgi, ortopædi og traumatologi. Autologe knogletransplantater ikke kun erstatte manglende ben, de støtter også den komplekse proces af knogle regeneration. Denne gunstige adfærd autotransplantater tilskrives de tre karakteristika: osteokonduktivitet, osteogenicity og osteoinductivity. Men der er et andet aspekt: knogletransplantater frigive et utal af molekyler, herunder vækstfaktorer, som kan målrette mesenkymale celler involveret i knogleregenerering. De parakrine egenskaber knogletransplantater kan studeres in vitro ved anvendelse af knogle-konditioneret medium (BCM). Her præsenterer vi en protokol om, hvordan man forbereder knogle-medium fra indfødte gris knoglecortex, og knogle, der undergik termisk behandling eller demineralisering. Celler kan udsættes direkte for BCM eller podet på biomaterialer, såsom kollagenmembraner, der tidligere gennemvædet med BCM. Vi giver eksempler på in vitro bioassays med mesenkymale celler på ekspression af TGF-β regulerede gener. De præsenterede protokoller bør tilskynde til yderligere afsløre parakrine virkninger af knogletransplantater under knogle regeneration og åbne en vej for translationel forskning i bred inden for rekonstruktionskirurgi.
Introduction
Autolog knogle er almindeligt anvendt til at bygge bro fejl, der opstod som følge af misdannelser, resective kirurgi, rekonstruktionskirurgi traume kirurgi, og før implantatet placering 1,2. Forståelse af de biologiske principper hvordan knogletransplantater støtte processen med graft konsolidering ikke kun nøglen til at forstå, hvorfor autografter anses for at være den gyldne standard i rekonstruktionskirurgi, er det også bionic den forbedrede udformning af knogle- substitutter 3. Stadig, graft konsolidering er hurtigere med autolog knogle sammenlignet med knogle erstatter 4,5. Således er det absolut nødvendigt at afsløre de molekylære og cellulære mekanismer, der gør autolog knogle så effektiv til at understøtte knogle regeneration.
Der er tre lærebog karakteristika autotransplantater, der anses for at støtte konsolideringen 6,7. Først, autolog knogle er osteokonduktivt, giver vejledning til den nydannede knogle til at voksei defekten. For det andet, autolog knogle er osteogene, hvilket betyder, at det indeholder mesenkymale celler, som kan differentiere til osteoblaster 8. Tredje, autolog knogle er osteoinduktive vækstfaktorer som knoglemorfogenetiske proteiner begravet i matrixen kan initiere processen med endochondral eller endda intramembranous knogledannelse 9. Der er et andet aspekt: frisklavede knogle chips holde en parakrin funktion baseret på in vitro-observationer med "ben-medium" 10-15. Også virkningen af myelopoiesis bør nævnes 16. En lignende udtrykket "demineraliseret knoglematrix-medium" var allerede opfundet i 1996 og støtter det overordnede begreb en parakrin funktion af knogler, selv når behandlet af demineralisering 17. Til vores formål, kan BCM fremstilles fra frisk gris mandibles 10,11. Proteomikanalyser af BCM afslørede komplekse sammensætning, herunder vækst omstændighedors og bestanddele af den ekstracellulære matrix 10, også udvidelse af eksisterende viden om proteasomet af hele ben 18,19. Således bør BCM afspejle den frigjorte aktivitet af forskellige modifikationer af knogletransplantater in vitro.
Hvad sker der, når mesenchymceller, for eksempel dem isoleret fra knogle chips eller fra oral blødt væv, er udsat til BCM? In vitro, BCM reducerer osteogenisk og adipogenisk differentiering, og fremkalder en kraftig stigning i IL11 udtryk 11. Genom microarray afslørede flere gener, der skal udtrykkes forskelligt i mesenkymale celler som reaktion på BCM. Blandt disse gener er adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4 eller lubricin) og pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM fås fra autoklaveres knogle chips undladt at ændre ekspressionen af de respektive gener 14. BCM fra knogle chips, der undergik pasteurisering og frysning var i stand tilændre genekspression 14. Også konditionerede medium af demineraliseret knoglematrix (DBM-CM) ændrer ekspressionen af TGF-β-regulerede gener 20. Interessant collagen barrieremembraner anvendes til at afskærme knoglefliserne fra det omgivende bløde væv 21,22, adsorberet de dele af BCM, der er ansvarlig for de ændringer i genekspression 23. BCM forskning kan udvides til andre celletyper, der er involveret i knogleregenerering såsom knogleresorberende osteoclaster og endotelceller, for at nævne nogle få. Samlet set akkumulerende in vitro-data giver det videnskabelige grundlag for udformningen af en præklinisk undersøgelse.
Den nuværende protokol er dobbelt: For det første viser, hvordan man forbereder BCM. For det andet viser, hvordan at teste dets biologiske aktivitet baseret på mesenchymal-celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Knogle-konditioneret medium afspejler den frigivne aktivitet af knogletransplantater under de tidlige stadier af knogleregenerering. Den her beskrevne protokol kan tilpasses til at studere responset af forskellige typer af celler involveret i knogleregenerering. Endvidere kan protokollen anvendes til fremstilling af konditioneret medium fra forarbejdede knogle- eller knogle fyldstoffer. Metoderne er let at udføre og stole på et simpelt koncept: de faktorer, der frigives fra diverse indfødte og bearbejdet knogle. Fors…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
Riferimenti
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
