Bone Geconditioneerd Medium: Voorbereiding en Bioassay
Summary
We beschrijven hier hoe-bone geconditioneerd medium (BCM) voor te bereiden en te testen zijn activiteit in vitro.
Abstract
Autologe bottransplantaten worden op grote schaal gebruikt in de kaakchirurgie, orthopedie en traumatologie. Autologe bottransplantaten vervangen niet alleen ontbreekt het bot, maar ook ondersteuning van het complexe proces van botregeneratie. Deze gunstige gedrag autografts wordt toegeschreven aan drie kenmerken: osteoconductiviteit, osteogenicity en osteo-inductiviteit. Er is echter een ander aspect: Bone ent laat een groot aantal moleculen, zoals groeifactoren, die mesenchymale cellen die betrokken zijn bij botherstel kunnen richten. De paracriene eigenschappen van bottransplantaten worden bestudeerd in vitro door het gebruik van bot-geconditioneerde medium (BCM). Hier presenteren we een protocol over hoe bot geconditioneerd medium te bereiden van inheemse varken corticale bot en bot dat de thermische verwerking of demineralisatie onderging. Cellen kunnen direct worden blootgesteld aan BCM en gezaaid op biomaterialen, zoals collageen membranen, vooraf gedrenkt BCM. We geven voorbeelden van in vitro bioassays met mesenchymale cellen op de expressie van TGF-β gereguleerde genen. De gepresenteerde protocollen moeten aanmoedigen om de paracriene effecten van bottransplantaten verdere onthullen tijdens de regeneratie van bot en een pad voor translationeel onderzoek te openen op het brede terrein van de reconstructieve chirurgie.
Introduction
Autoloog bot wordt veel gebruikt om defecten die ontstaan als gevolg van misvorming, chirurgische resectie, reconstructieve chirurgie trauma, en voorafgaand aan implantatie 1,2 overbruggen. Het begrijpen van de biologische principes hoe bottransplantaten ondersteunen van het proces van transplantaat consolidatie niet alleen belangrijk om te begrijpen waarom autografts worden beschouwd als de gouden standaard in reconstructieve chirurgie, is het ook bionische de verbeterde constructie van botsubstituten 3. Toch graft consolidatie is sneller met autoloog bot ten opzichte van het bot vervangt 4,5. Derhalve is het noodzakelijk om de moleculaire en cellulaire mechanismen die autoloog bot zo effectief botregeneratie te ondersteunen onthullen.
Er zijn drie leerboek kenmerken autografts die geacht worden de consolidatieproces 6,7 ondersteunen. Ten eerste, autoloog bot is osteoconductief, het verstrekken van begeleiding van de nieuw gevormde bot te groeienin het defect. Ten tweede, autoloog bot is osteogene, wat betekent dat het bevat mesenchymale cellen die kunnen differentiëren tot osteoblasten 8. Ten derde, autoloog bot is osteoinductieve als groeifactoren, zoals bot morfogenetische eiwitten begraven in de matrix het proces van endochondrale of zelfs intramembraneuze botvorming 9 kan initiëren. Er is een ander aspect: vers bereide botsplinters bezit van een paracrine functie op basis van de in vitro waarnemingen met "-bone geconditioneerd medium" 10-15. Ook zou de invloed van myelopoiese worden vermeld 16. Een soortgelijke term "gedemineraliseerd bot-matrix geconditioneerd medium" was al bedacht in 1996 en steunt het algemene concept van een paracriene functie van het bot, zelfs wanneer verwerkt door demineralisatie 17. Voor onze doeleinden, kunnen BCM worden bereid uit verse varken kaken 10,11. Proteomics analyses van BCM bleek de complexe samenstelling, met inbegrip van de groei feitors en bestanddelen van de extracellulaire matrix 10, ook de uitbreiding van bestaande kennis op het proteasoom van hele bot 18,19. Daarom moet de BCM vrijgegeven activiteit van verscheidene modificaties van bottransplantaten in vitro geven.
Wat gebeurt er als mesenchymale cellen, bijvoorbeeld die geïsoleerd uit botsplinters of orale zachte weefsel, blootgesteld aan BCM? In vitro, BCM vermindert osteogene en adipogene differentiatie, en veroorzaakt een sterke toename van IL11-expressie 11. Chromosomale microarray geopenbaard meer genen differentieel tot expressie worden gebracht in mesenchymale cellen in respons op BCM. Onder deze genen adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (NOX4), proteoglycan 4 (PRG4 of lubricin) en pentraxine 3 (PTX3) 15. BCM verkregen uit autoclaaf botsplinters niet de expressie van de respectieve genen 14 veranderen. BCM uit het bot chips die pasteurisatie ondergaan en bevriezing was in staat omveranderen genexpressie 14. Ook geconditioneerd medium gedemineraliseerd botmatrix (DBM-CM) verandert de expressie van TGF-β-gereguleerde genen 20. Interessant collageen barrièremembranen gebruikt om het bot chips te beschermen tegen de omringende zachte weefsels 21,22, geadsorbeerd die delen van BCM die verantwoordelijk zijn voor de veranderingen in genexpressie 23 zijn. BCM onderzoek kan worden uitgebreid tot andere celtypen betrokken bij botherstel zoals botresorberende osteoclasten en endotheliale cellen, een paar te noemen. Kortom, het accumuleren in vitro data over wetenschappelijke basis voor het ontwerp van een preklinisch onderzoek.
Het huidige protocol is tweeledig: ten eerste, het laat zien hoe de BCM te bereiden. Ten tweede laat zien hoe de biologische activiteit ervan te testen op basis van mesenchymale cellen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bone-geconditioneerd medium weerspiegelt de activiteit bezit van bottransplantaten in de eerste fasen van botregeneratie. De hier beschreven protocol kan worden aangepast aan de respons van verschillende soorten cellen die betrokken zijn bij botherstel te bestuderen. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om geconditioneerd medium verwerkte bot of vulstoffen te bereiden. De werkwijzen zijn eenvoudig uit te voeren en vertrouwen op een eenvoudig concept: de factoren vrijgemaakt uit diverse natieve en verwerkt bot. Beg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
Riferimenti
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
