Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay
Summary
Wir beschreiben hier, wie man Knochen-konditionierten Medium (BCM) vorbereiten und testen ihre Aktivität in vitro.
Abstract
Autologe Knochentransplantate sind weit verbreitet in der MKG-Chirurgie, Orthopädie, Traumatologie und verwendet. Autologe Knochentransplantate nicht nur fehlenden Knochen zu ersetzen, sie unterstützen auch den komplexen Prozess der Knochenregeneration. Dieses günstige Verhalten des Autografts ist mit den drei Eigenschaften zugeschrieben: Osteokonduktivität, osteogenicity und Osteoinduktivität. Es besteht jedoch ein weiterer Aspekt: Knochentransplantate setzen eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren, die mesenchymalen Zellen in der Knochenregeneration beteiligten Ziel kann. Die parakrine Eigenschaften von Knochentransplantaten in vitro durch die Verwendung von Knochen-konditionierten Mediums (BCM) untersucht werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, wie man Knochen-konditioniertes Medium von einheimischen Schweine kortikalen Knochen vorzubereiten und Knochen, die thermische Verarbeitung oder Entsalzung unterzogen. Zellen können direkt an BCM ausgesetzt oder auf Biomaterialien, wie Kollagen Membranen, die zuvor mit BCM getränkt ausgesät werden. Wir geben Beispiele für die in vitro bioassays mit mesenchymalen Zellen auf die Expression von TGF-β reguliert Gene. Die vorgestellten Protokolle sollten ermutigen, die parakrine Wirkung von Knochentransplantaten weiter enthüllen während die Knochenregeneration und öffnen Sie einen Pfad für die translationale Forschung auf dem weiten Feld der rekonstruktiven Chirurgie.
Introduction
Autologem Knochen wird häufig eingesetzt, um Mängel, die als Folge der Fehlbildung, resektive Chirurgie, Rekonstruktive Unfallchirurgie, und vor der Implantation 1,2 aufgetreten brücken. Das Verständnis der biologischen Grundlagen, wie Knochentransplantate unterstützen den Prozess der Konsolidierung Transplantat ist nicht nur Schlüssel, um zu verstehen, warum Autotransplantate gelten als der Goldstandard in der rekonstruktiven Chirurgie, ist es auch bionic der verbesserten Gestaltung von Knochenersatz 3. Dennoch ist Transplantat Konsolidierung schneller mit autologem Knochen im Vergleich zu Knochenersatz 4,5. Daher ist es zwingend notwendig, um die molekularen und zellulären Mechanismen, die autologe Knochen so wirksam ist, um die Knochenregeneration zu unterstützen offenbaren.
Es gibt drei Lehrbuch Merkmale der Autotransplantate, die berücksichtigt werden, um den Konsolidierungsprozess 6,7 unterstützt. Zunächst wird autologen Knochen ist osteokonduktive, die Beratung für den neu gebildeten Knochen zu wachsenin den Defekt. Zweitens ist die autologe Knochen osteogenen, dh es mesenchymalen Zellen, zu Osteoblasten differenzieren können 8 enthält. Drittens autologem Knochen osteoinduktiven Wachstumsfaktoren wie bone morphogenetic proteins in der Matrix vergraben können den Prozess der enchondralen oder sogar intramembranous Knochenbildung 9 einzuleiten. Es ist ein weiterer Aspekt: frisch hergestellten Knochenchips halten eine parakrine Funktion auf der Grundlage der in vitro-Beobachtungen mit "Knochen-konditioniertes Medium" 10-15. Auch die Auswirkungen der Myelopoese sollte erwähnt 16 werden. Ein ähnlicher Begriff "demineralisierte Knochenmatrix-konditioniertes Medium" wurde bereits 1996 geprägt und unterstützt das Gesamtkonzept einer parakrinen Funktion von Knochen, selbst wenn sie durch Demineralisierung 17 verarbeitet. Für unsere Zwecke können BCM von frischem Schweinefleisch hergestellt werden Mandibeln 10,11. Proteom-Analysen von BCM zeigte die komplexe Zusammensetzung, einschließlich des Wachstums der Tators und Bestandteile der extrazellulären Matrix 10, der sich auch das vorhandene Wissen auf dem Proteasom der ganzen Knochen 18,19. So sollte BCM spiegeln die Freigabe Aktivität verschiedener Modifikationen von Knochentransplantaten in vitro.
Was passiert, wenn mesenchymalen Zellen, beispielsweise die aus Knochenspäne oder von oralen Weichgewebe isoliert, ausgesetzt sind BCM? In vitro, BCM verringert osteogene und adipogenen Differenzierung und provoziert eine starke Zunahme der IL11 Ausdruck 11. Genomweite Mikroarray ergab mehr Gene differentiell in mesenchymalen Zellen in Reaktion auf BCM ausgedrückt werden. Unter diesen Genen sind Adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH-Oxidase-4 (NOX4), Proteoglycan 4 (PRG4 oder lubricin) und Pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM autoklaviert Knochenspänen erhalten konnte die Expression der jeweiligen Gene 14 ändern. BCM von Knochenchips, die Pasteurisierung unterzogen und das Einfrieren der Lage war,ändern Genexpression 14. Auch konditionierte Medium demineralisierte Knochenmatrix (DBM-CM) verändert die Expression von TGF-β-regulierte Gene 20. Interessanterweise Kollagen Barrieremembranen verwendet, um die Knochenspäne aus dem umgebenden Weichgewebe 21,22 abzuschirmen, adsorbiert die Teile des BCM, das für die Veränderungen in der Genexpression, 23 verantwortlich sind. BCM Forschung kann auf andere in der Knochenregeneration beteiligt wie Knochen-Osteoklasten und Endothelzellen Zelltypen erweitert werden, um einige zu nennen. Insgesamt sind die anfallenden in-vitro-Daten liefern die wissenschaftliche Grundlage für die Gestaltung einer präklinischen Studie.
Dieses Protokoll ist zweifach: Erstens zeigt es, wie man BCM vorzubereiten. Zweitens zeigt sie, wie seine biologische Aktivität getestet anhand von mesenchymalen Zellen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Knochen-konditionierten Medium reflektiert die Freigabe Aktivität von Knochentransplantaten in den frühen Phasen der Knochenregeneration. Das hier beschriebene Protokoll angepasst ist, die Reaktion der verschiedenen Arten von Zellen in der Knochenregeneration zu studieren. Darüber hinaus kann das Protokoll, mit dem konditionierten Medium von verarbeiteten Knochen oder Knochen Füllstoffe verwendet werden. Die Methoden sind einfach durchzuführen und sich auf ein einfaches Konzept: der Faktoren aus verschiedenen einhe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
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