בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק
Summary
אנו מתארים כאן כיצד להכין מדיום מיזוג עצם (BCM) ולבדוק את פעילותו במבחנה.
Abstract
שתלי עצם אוטולוגית נמצאים בשימוש נרחב בניתוח, אורתופדיה, וtraumatology פה והלסתות. שתלי עצם אוטולוגית לא רק להחליף עצם חסר, הם גם תומכים בתהליך המורכב של התחדשות עצם. התנהגות חיובית זו של autografts מיוחסת לשלושה מאפיינים: osteoconductivity, osteogenicity, וosteoinductivity. עם זאת, יש היבט נוסף: העצם שתל לשחרר מספר עצום של מולקולות, כולל גורמי גדילה, אשר יכול למקד תאי mesenchymal המעורבים בהתחדשות עצם. המאפיינים אוטוקריני של שתלי עצם ניתן ללמוד במבחנה על ידי השימוש במדיום מיזוג עצם (BCM). כאן אנו מציגים פרוטוקול על איך להכין מדיום מיזוג עצם מעצם קליפת המוח חזיר ילידים, ועצם שעבר תהליך עיבוד או איבוד מינרלים תרמיים. תאים יכולים להיות חשופים ישירות לBCM או זורעים על ביו-חומרים, כגון ממברנות קולגן, ספוג בעבר עם BCM. אנחנו נותנים דוגמאות במבחנת bioassaי"ש עם תאי mesenchymal בביטוי של גנים מוסדרים TGF-β. הפרוטוקולים שהוצגו לעודד לחשוף עוד יותר את ההשפעות אוטוקריני של שתלי עצם במהלך התחדשות עצם ולפתוח נתיב למחקר translational בתחום הרחב של ניתוח שחזור.
Introduction
עצם אוטולוגית נעשה שימוש נרחב לגשר פגמים שנפלו כתוצאה ממום, ניתוח resective, ניתוח שחזור טראומה, ולפני מיקום שתל 1,2. הבנת העקרונות הביולוגיים של כמה תלי עצם לתמוך בתהליך של איחוד שתל היא לא מפתח היחיד להבין מדוע autografts נחשב סטנדרטי בניתוח שחזור הזהב, הוא גם יונית לעיצוב המשופר של תחליפי עצם 3. ובכל זאת, איחוד שתל הוא מהיר יותר עם עצם אוטולוגית לעומת עצם תחליפי 4,5. לפיכך, הוא הכרחי כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים ותאיים שגורמים עצם אוטולוגית כל כך יעיל לתמיכה בהתחדשות עצם.
ישנם שלושה מאפייני ספר לימוד של autografts שנחשבים לתמיכה בתהליך האיחוד 6,7. העצם ראשון, אוטולוגית הוא osteoconductive, מתן הדרכה לעצם החדש שנוצר לגדוללפגם. שנית, עצם אוטולוגית הוא osteogenic, כלומר הוא מכיל תאי mesenchymal שיכול להתמיין לosteoblasts 8. עצם שלישי, אוטולוגית הוא osteoinductive כגורמי גדילה כמו חלבוני המוךפו"גנטי העצם קבורים במטריצה יכולים להתחיל בתהליך של endochondral או אפילו יצירת עצם intramembranous 9. יש היבט נוסף: שבבי עצם מוכנים טרי להחזיק פונקציה אוטוקריני מבוססת על התצפיות במבחנה עם "בינוני מותנה עצם" 10-15. גם את ההשפעה של myelopoiesis יצוין 16. טווח דומה "בינוני עצם demineralized מיזוג מטריצה" כבר נטבע בשנת 1996 ותומך ברעיון הכללי של פונקציה אוטוקריני של עצם, גם כאשר מעובד על ידי איבוד מינרלים 17. למטרות שלנו, BCM יכול להיות מוכן מחזיר טרי לסתות 10,11. ניתוחי proteomic של BCM חשפו את ההרכב המורכב, הכוללים למעשה צמיחהORS ומרכיבים של מטריקס 10, גם הרחבת ידע הקיים בפרוטאזום של כל עצם 18,19. לפיכך, BCM צריך לשקף את הפעילות המסחרית של שינויים שונים של שתלי עצם במבחנה.
מה קורה כאשר תאי mesenchymal, למשל אלה מבודדים משבבי עצם או מרקמות רכות בעל פה, נחשפים לBCM? במבחנה, BCM מפחית osteogenic ובידול adipogenic, ומעורר עלייה חזקה של ביטוי IL11 11. הגנום microarray הרחב גילה גנים רבים יותר לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאי mesenchymal בתגובה לBCM. בין הגנים הללו adrenomedullin (ADM) הם, IL11, IL33, מונואמין NADPH 4 (NOX4), פרוטאו 4 (PRG4, או lubricin) וpentraxin 3 (PTX3) 15. BCM מתקבל משבבי עצם autoclaved לא הצליח לשנות את הביטוי של גנים בהתאמה 14. BCM משבבי עצם שעברו פסטור והקפאה היה מסוגללשנות ביטוי גני 14. בינוני גם מותנה של מטריצת demineralized עצם (DBM-CM) משנה את הביטוי של TGF-β-מוסדרת גנים 20. מעניין לציין, קרומי מחסום קולגן משמשים להגן על שבבי עצם מהרקמות הרכות סביב 21,22, נספחים אותם חלקים של BCM שאחראים לשינויים בביטוי הגנים 23. מחקר BCM יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים מעורבים בהתחדשות עצם כגון osteoclasts resorbing-עצם ותאי האנדותל, עד כמה שם. בסך הכל, במבחנה נתוני צבירה לספק את הבסיס המדעי לעיצובו של מחקר פרה-קליני.
הפרוטוקול הנוכחי הוא כפול: ראשית, הוא מראה כיצד להכין BCM. שנית, הוא מראה איך לבדוק הפעילות הביולוגית שלה מבוסס על תאי mesenchymal במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בינוני-מותנה עצם משקף את הפעילות המסחרית של שתלי עצם בשלבים המוקדמים של התחדשות עצם השלבים. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים ללמוד את תגובת סוגים שונים של תאים מעורבים בהתחדשות עצם של. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי להכין מדיום מותנה ממילוי עצם או עצם מעובד. השיטו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
Riferimenti
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
