Summary
Descrevemos aqui como preparar meio-bone condicionado (BCM) e testar a sua actividade in vitro.
Abstract
Enxertos ósseos autólogos são amplamente utilizados em cirurgia oral e maxilofacial, ortopedia, traumatologia e. Enxertos ósseos autólogos não só substituir osso em falta, eles também suportam o complexo processo de regeneração óssea. Esse comportamento favorável dos auto-enxertos é atribuído às três características: osteocondutividade, osteogenicidade, e osteoindutividade. No entanto, há um outro aspecto: Enxerto ósseo libertar uma miríade de moléculas, incluindo factores de crescimento, que podem direcionar as células mesenquimatosas envolvidas na regeneração óssea. As propriedades parácrinos de enxertos de osso pode ser estudada in vitro através da utilização de meio condicionado de ossos (BCM). Aqui apresentamos um protocolo sobre como preparar o meio-condicionado de osso nativo osso cortical suíno e osso que foram submetidos a tratamento térmico ou desmineralização. As células podem ser directamente exposta à BCM ou semeados em biomateriais, tais como membranas de colágeno, previamente embebidos com BCM. Nós damos exemplos de in vitro bioassays com células mesenquimais sobre a expressão de TGF-β genes regulados. Os protocolos apresentados devem incentivar a revelar ainda mais os efeitos parácrinos de enxertos ósseos durante a regeneração óssea e abrir um caminho para a investigação translacional no amplo campo da cirurgia reconstrutiva.
Introduction
Ósseo autólogo é amplamente utilizado para preencher defeitos que ocorreram como consequência de malformação, a cirurgia ressectivo, a cirurgia reconstrutiva trauma, e antes da colocação do implante 1,2. Compreender os princípios biológicos de como enxertos ósseos apoiar o processo de consolidação do enxerto não é única chave para entender porque auto-enxertos são considerados o padrão-ouro em cirurgia reconstrutiva, também é biônico para o projeto melhorado de substitutos ósseos 3. Ainda assim, a consolidação do enxerto é mais rápido com ósseo autólogo em comparação com osso substitui 4,5. Assim, é imperativo para revelar os mecanismos moleculares e celulares que formam osso autólogo de modo eficaz para apoiar a regeneração do osso.
Existem três características exemplares de auto-enxertos que são considerados para suportar o processo de consolidação 6,7. Primeiro osso, autólogo é osteocondutor, fornecendo orientações para o osso recém-formado para crescerno defeito. Em segundo lugar, osso autólogo é osteogénico, o que significa que ele contém células mesenquimais que podem diferenciar-se em osteoblastos 8. Terceiro osso, autólogo é osteoindutora como fatores de crescimento, como proteínas ósseas morfogenéticas sepultados na matriz pode iniciar o processo de endochondral ou mesmo a formação óssea intramembranosa 9. Há um outro aspecto: fragmentos de ossos recém-preparados realizar uma função parácrina baseado nas observações in vitro com "meio-bone condicionado" 10-15. Além disso, o impacto da mielopoese deve ser mencionado 16. Um termo similar "meio condicionado-matriz óssea desmineralizada" já foi cunhado em 1996 e apoia o conceito global de uma função parácrina do osso, mesmo quando processados por desmineralização 17. Para nossos propósitos, BCM pode ser preparado a partir de suíno fresca mandíbulas 10,11. Análises proteômicas de BCM revelou a composição complexa, incluindo facto crescimentoRUP e constituintes da matriz extracelular 10, estendendo-se também ao conhecimento existente sobre o proteassoma de osso total 18,19. Assim, BCM deve refletir a atividade liberada de várias modificações de enxertos ósseos in vitro.
O que acontece quando células mesenquimatosas, por exemplo, os isolados a partir de lascas de osso ou de tecidos moles da boca, são expostos para BCM? In vitro, o BCM reduz osteogénico e osteócito, e provoca um forte aumento da expressão IL11 11. Genoma de largura de microarray revelou mais genes a ser expressos diferencialmente em células mesenquimais em resposta ao BCM. Entre estes genes são adrenomedullin (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidase 4 (Nox4), proteoglicanos 4 (PRG4, ou lubricin) e pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM obtido a partir de fragmentos de ossos autoclavada não conseguiu alterar a expressão dos respectivos genes 14. BCM a partir de fragmentos de ossos que foram submetidos a pasteurização eo congelamento foi capaz dealterar a expressão do gene 14. Meio também condicionado da matriz óssea desmineralizada (DBM-CM) muda a expressão de TGF-β genes regulados por 20. Curiosamente, as membranas barreira de colagénio utilizadas para proteger os fragmentos de ossos do tecido mole circundante 21,22, adsorvido às partes de BCM que são responsáveis para que as alterações na expressão do gene 23. BCM pesquisa pode ser alargado a outros tipos de células envolvidas na regeneração do osso, tais como os osteoclastos de reabsorção óssea e células endoteliais, para citar alguns. No geral, os dados in vitro acumulando proporcionar a base científica para a concepção de um estudo pré-clínico.
O presente protocolo é duplo: Primeiro, ele mostra como preparar BCM. Em segundo lugar, como mostra a testar a sua actividade biológica com base em células mesenquimais in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meio condicionado por óssea reflecte a actividade libertada de enxertos de osso durante os estágios iniciais de regeneração óssea. O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para estudar a resposta de diferentes tipos de células envolvidas na regeneração óssea. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para preparar o meio condicionado a partir de agentes de enchimento de osso ou ossos processados. Os métodos são fáceis de realizar e contam com um conceito simples: os fatores libertados por várias osso n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
Riferimenti
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
