Isolering og transplantation af forskellige Aged murine Thymic udtagne transplantater.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
De mekanismer, der regulerer effekten af thymus udvælgelse forbliver dårligt defineret. Den præsenteres her metode tillader in vivo analyser af udviklingen og udvælgelsen af T-celler, der er specifikke for selv og fremmede antigener. Tilgangen indebærer implantation af thymiske transplantater afledt af forskellige ældre mus i immundefekte SCID modtagere. Over en relativt kort periode modtagerne er fuldt rekonstitueret med T-celler afledt fra den implanterede thymus graft. Kun thymocyter podning thymus på tidspunktet for isolation undergår udvælgelse og udvikle sig til modne T-celler. Som sådan kan ændringer i naturen og specificiteten af de indpodede T-celler som en funktion af alder-afhængige thymiske hændelser vurderes. Selv teknisk ekspertise kræves for vellykket thymus transplantation, denne fremgangsmåde tilvejebringer en unik strategi til at studere in vivo en bred vifte af patologier, som skyldes eller et resultat af aberrerende brisselfunktion og / eller homeostaser.
Introduction
Den thymus er et organ, hvor kritiske hændelser i T-celle udvikling forekommer 1. Resident thymocytter, ved omlejring af T-cellereceptoren (TCR) α og β gener, gennemgå en række interaktioner med lymphostromal og antigenpræsenterende celler (APC) i de kortikale og medullære regioner i thymus 2. Thymus positiv selektion medieres af corticale thymiske epitelceller (TEC) til fremstilling af thymocytter der genkender antigene peptider i forbindelse med værten dominerende histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II-molekyler 2-3. Efterfølgende thymisk negativ udvælgelse indebærer rensning af autoreaktive thymocytter, drevet af en interaktion med medullær TEC eller dendritiske celler (DC) at de nuværende peptider afledt af selvproteiner bundet af MHC klasse I og II-molekyler 3. Slutresultatet af disse processer er etableringen af en pulje af modent CD4 + og CD8 + T-celler i stand til at reagere på et bredt spektrumaf fremmede antigener, mens udstille minimal reaktivitet til selvproteiner 4.
Effektiviteten af thymiske udvalg begivenheder påvirkes af en række faktorer, herunder thymus modning, hyppigheden af medullær og kortikal TEC, delmængde sammensætning thymisk DC, og kilden til thymiske forstadier 3. Især kan afvigende thymisk valg resultere i autoimmune 5 eller immundefekte patologier, som stammer fra nedsat negativ eller positiv selektion hhv. De molekylære begivenheder, der regulerer thymus udvælgelse, er imidlertid dårligt forstået. In vitro metoder såsom reaggregate thymiske organkulturer (RTOC) 6, har vist sig at være nyttige til analyse af grundlæggende begivenheder forbundet med thymus udvælgelse, men ikke fuldt ud rekapitulere dynamikken i igangværende in vivo arrangementer. Som følge heraf var dette thymus transplantation tilgang etableret til bedre undersøgelse thymocyt udvælgelse begivenheder in vivo 7 </sop>.
Denne protokol beskriver transplantere thymi fra nyfødte og voksne donormus i immundefekte scid recipientmus. Denne teknik tillader studiet af mekanismer, der regulerer positiv og negativ selektion thymus, samt thymus produktion af forskellige T-celle-undergrupper under ontogenese. Senest har denne tilgang blevet anvendt til at påvise, at effektiviteten af thymus valg er begrænset tidligt efter fødslen i mus fører til øget udvikling af autoreaktive T-celler, og en reduceret T-celle repertoire specifik for fremmede antigener 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
Riferimenti
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
