Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Die Mechanismen, die die Wirksamkeit von Thymus Auswahl, zu regeln schlecht definiert. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht in vivo-Analysen von der Entwicklung und Auswahl bestimmter für Selbst- und Fremdantigene T-Zellen. Der Ansatz beinhaltet die Implantation von Thymus-Transplantate aus verschiedenen alten Mäusen in immundefiziente SCID-Empfänger ab. Über einen relativ kurzen Zeitraum die Empfänger sind mit T-Zellen aus dem Thymus implantierten Transplantats abgeleitet rekonstituiert. Nur Thymozyten Impfen der Thymus zum Zeitpunkt der Trennung zu unterziehen Auswahl und entwickeln sich zu reifen T-Zellen. Als solches können Änderungen in der Art und Spezifität der transplantierten T-Zellen als Funktion der altersabhängigen Thymus Ereignisse bewertet werden. Obwohl technische Know-how für erfolgreiche Thymus-Transplantation erforderlich ist, stellt dieses Verfahren eine einzigartige Strategie, um in vivo zu untersuchen eine breite Palette von Krankheiten, die durch oder aufgrund der abweichenden Thymus-Funktion und / oder sind homeostasist.
Introduction
Der Thymus ist ein Organ, in dem kritische Ereignisse in T-Zell-Entwicklung entstehen 1. Resident Thymozyten auf Umlagerung des T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β-Gene, durchlaufen eine Reihe von Interaktionen mit lymphostromal und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Rinde und Mark Regionen des Thymus 2. Thymus-positive Selektion durch kortikale Thymusepithelzellen (TEC) vermittelte, um Thymozyten, die antigene Peptide im Kontext der Host Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II-Moleküle erkennen 2-3 herzustellen. Nachfolgende Thymus negative Selektion bringt Spülen von autoreaktiven Thymozyten, durch eine Wechselwirkung mit Mark TEC oder dendritischen Zellen (DC), die vorhanden Peptide aus Selbstproteine durch MHC-Klasse-I und II-Moleküle gebunden 3 abgeleitet angetrieben. Das Ergebnis dieser Prozesse ist die Einrichtung eines Pools von reifen CD4 + und CD8 + T-Zellen in der Lage, ein breites Spektrum reagierenFremdgene während sie eine minimale Reaktivität mit Eigenproteine 4.
Die Effizienz des Thymus Auswahlereignisse durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich Thymus-Reifung, die Häufigkeit der Mark und kortikaler TEC Teilzusammensetzung Thymus DC, und die Source des Thymus Vorstufen 3 beeinflusst. Bemerkenswert ist, können abweichende Thymus-Auswahl bei Autoimmun 5 oder immundefizienten Pathologien, die von eingeschränkter negative oder positive Selektion entstehen beziehungsweise führen. Die molekularen Ereignisse regulieren Thymus Auswahl, sind jedoch kaum verstanden. In vitro-Ansätze wie reaggregieren Thymus-Organkulturen (RTOC) 6, haben sich als nützlich für die Analyse von Basisereignissen mit Thymus Auswahl zugeordnet ist, aber nicht, um die Dynamik der laufenden vollständig rekapitulieren In-vivo-Veranstaltungen. Als Folge wurde dieses Thymus-Transplantation-basierten Ansatz für eine bessere Studien thymocyte Auswahl Veranstaltungen in vivo 7 fest </sup>.
Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation Thymi von Neugeborenen und erwachsenen Spendermäusen in immundefiziente SCID-Empfängermäuse. Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Mechanismen, die positive und negative Selektion Thymus sowie Thymusfunktion verschiedener T-Zell-Teilmengen während der Ontogenese regulieren. In jüngster Zeit wurde dieser Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass die Effizienz des Thymus Auswahl früh nach der Geburt in Mäusen führt zu einer erhöhten Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen, und für die Fremdantigene 7 eine reduzierte T-Zell-Repertoire spezifisch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
Riferimenti
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