בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
המנגנונים המסדירים את היעילות של בחירת הרתי יישארו לא מוגדר. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת in vivo ניתוחים של הפיתוח והבחירה של תאי T ספציפיים לעצמית ואנטיגנים זרים. הגישה כרוכה השתלה של שתלי הרתי נגזרים מעכברים בגילים שונים למקבלי SCID immunodeficient. על פני תקופה קצרה יחסית של זמן הנמענים מחדש באופן מלא עם תאי T הנגזרים משתל התימוס המושתל. רק thymocytes זריעת התימוס בעת הבידוד לעבור בחירה ולהתפתח לתאי T בשלים. ככזה, שינויים באופי והספציפיות של תאי T engrafted כפונקציה של אירועי הרתי תלוי גיל ניתן להעריך. למרות שנדרשה מומחיות טכנית להשתלה הרתי מוצלחת, שיטה זו מספקת אסטרטגיה ייחודית ללמוד in vivo מגוון רחב של פתולוגיות המגיעות לי או תוצאה של פונקצית הרתי חריגה ו / או homeostasהוא.
Introduction
התימוס הוא איבר שבו אירועים קריטיים בהתפתחות תאי T להתרחש 1. thymocytes התושב, עם סידורו מחדש של הקולטן תא T α (TCR) וגני β, לעבור סדרה של אינטראקציות עם תאי lymphostromal והצגת אנטיגן (APC) באזורים בקליפת המוח והלשדיים של בלוטת התימוס 2. בחירה חיובית הרתי מתווכת על ידי תאי אפיתל הרתי קליפת המוח (TEC) לייצר thymocytes שמכיר פפטידים אנטיגני בהקשר של מעמד מארח גדול המורכב histocompatibility (MHC) I ו- II מולקולות 2-3. סלקציה שלילית הרתי לאחר כרוכה טיהור של thymocytes אוטוריאקטיבים, מונעת על ידי אינטראקציה עם TEC הלשדי או תאים דנדריטים (DC) שפפטידים ההווה נגזרים מחלבונים עצמיים מחויבים אני כיתת MHC והשני מולקולות 3. התוצאה הסופית של תהליכים אלה היא הקמת מאגר של תאים בוגרים מסוג CD4 + CD8 + T ומסוגל להגיב לקשת רחבהשל אנטיגנים זרים ואילו בתערוכת תגובתיות מינימאלית לחלבונים עצמיים 4.
היעילות של אירועי בחירת הרתי מושפעת על ידי שורה של גורמים, כולל התבגרות הרתי, תדירות לשדית וTEC בקליפת המוח, הרכב משנה של DC הרתי, והמקור של מבשרי הרתי 3. יש לציין, בחירת הרתי חריגה יכולה לגרום לפתולוגיות אוטואימוניות 5 או immunodeficient, שנובעות מסלקציה שלילית או חיובית פגומה, בהתאמה. האירועים המולקולריים המסדירים בחירת הרתי, לעומת זאת, הם הבינו היטב. במבחנה גישות כגון תרבויות איבר הרתי reaggregate (RTOC) 6, הוכיח להיות שימושי לניתוח אירועים בסיסיים הקשורים לבחירת הרתי, אבל לא מצליחים לשחזר באופן מלא את הדינמיקה של שוטף באירועי vivo. כתוצאה מכך, גישה המבוססת על השתלת הרתי זה הוקמה לאירועי מבחר thymocyte מחקר טובים יותר in vivo 7 </sעד>.
פרוטוקול זה מתאר השתלת thymi מעכברי תורם יילוד והמבוגר לעכברים נמען SCID immunodeficient. טכניקה זו מאפשרת לחקר מנגנונים המווסתים את הבחירה חיובית ושלילית הרתי, כמו גם תפוקת הרתי של תת תא T השונים במהלך ontogeny. לאחרונה, גישה זו הייתה בשימוש על מנת להוכיח כי היעילות של בחירת הרתי מוגבלת המוקדמת לאחר הלידה בעכברים המובילה לפיתוח מוגבר של תאי T אוטוריאקטיבים, ורפרטואר של תאי T ספציפי למופחת אנטיגנים זרים 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
Riferimenti
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
