Isolasjon og Transplantasjon av forskjellige alderen Murine tymisk grafts.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Mekanismene som regulerer virkningen av thymus utvalg forblir dårlig definert. Metoden som presenteres her gjør in vivo analyser av utviklingen og utvalg av T-celler spesifikke for seg selv og fremmede antigener. Tilnærmingen innebærer implantasjon av tymiske grafts hentet fra ulike eldre mus inn immunsvikt SCID mottakere. I løpet av en relativt kort tidsperiode mottakerne er fullstendig rekonstituert med T-celler avledet fra den implanterte thymus pode. Bare thymocytter poding av thymus på tidspunktet for isolasjon gjennomgå seleksjon og utvikle seg til modne T-celler. Som sådan, kan forandringer i naturen og spesifisiteten til de innpodet T-celler som en funksjon av aldersavhengig tymiske hendelser bli vurdert. Selv om det teknisk kompetanse er nødvendig for vellykket thymisk transplantasjon, gir denne metoden en strategi for å studere in vivo et bredt spekter av patologier som skyldes eller et resultat av avvikende thymisk funksjon og / eller homeostaser.
Introduction
Thymus er et organ der kritiske hendelser i T celle utvikling oppstå en. Hørende thymocytter, ved omleiring av T-cellereseptoren (TCR) α og β gener, gjennomgår en serie av interaksjoner med lymphostromal og antigenpresenterende celler (APC) i de kortikale og medullære regioner av thymus 2. Tymisk positiv utvelgelse er mediert av kortikale tymiske epitel-celler (TEC) for å produsere tymocytter som gjenkjenner antigene peptider i sammenheng med verten hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II molekyler 2-3. Påfølgende thymic negativ seleksjon innebærer sletting av autoreaktive tymocytter, drevet av et samspill med medullær TEC eller dendrittiske celler (DC) som presenterer peptider som stammer fra selv proteiner bundet av MHC klasse I og II molekyler tre. Sluttresultatet av disse prosessene er etableringen av en pool av modent CD4 + og CD8 + T-celler i stand til å svare på et bredt spektrumav fremmede antigener mens utstilling minimal reaktivitet til selv proteiner fire.
Effektiviteten av tymiske utvalgs hendelser påvirkes av en rekke faktorer, inkludert thymic modning, hyppighet av medullær og kortikal TEC, undergruppe sammensetningen av thymic DC, og kilden til thymic forløpere tre. Spesielt, kan avvikende thymisk valg medføre autoimmune 5 eller immunsvikt patologier, som oppstår fra svekket negativ eller positiv seleksjon, respektivt. De molekylære hendelser som regulerer thymisk valg, men er dårlig forstått. In vitro tilnærminger som reaggregate tymiske organkulturer (RTOC) 6, har vist seg å være nyttig for å analysere grunn hendelser assosiert med thymus-utvalg, men mislykkes i å fullt ut rekapitulere dynamikken i løpende in vivo hendelser. Som et resultat ble det thymisk transplantasjon tilnærming etablert for å studere bedre thymocytt seleksjons hendelser in vivo 7 </sopp>.
Denne protokollen beskriver transplantere thymus fra nyfødte og voksne donor mus inn immunsvikt scid resipientmus. Denne teknikken gjør det mulig å studere mekanismene som regulerer positive og negative thymisk valg, samt tymisk produksjonen av forskjellige T-celleundersett under ontogeny. I det siste har denne metode blitt benyttet for å demonstrere at effektiviteten av thymus-valget er begrenset tidlig etter fødselen hos mus fører til økt utvikling av autoreaktive T-celler, og en redusert T-cellerepertoaret spesifikk for fremmede antigener 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
Riferimenti
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
