Выделение и Трансплантация различных престарелых мышиных тимуса трансплантатов.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Механизмы, которые регулируют эффективность тимуса выбора остаются плохо определены. Метод, представленный здесь позволяет в естественных условиях анализов разработки и отбора Т-клеток, специфичных для себя и чужеродных антигенов. Подход влечет за собой имплантацию тимуса трансплантатов, полученных от различных старых мышей в иммунодефицитных SCID получателей. За сравнительно короткий период времени получатели полностью восстанавливают Т-клеток, полученных из тимуса имплантированного трансплантата. Только тимоцитов посева тимус во время изоляции испытывают выбор и развиваться в зрелые Т-клеток. Таким образом, изменения в природе и специфичность Т-клеток привитых в зависимости от возрастных тимуса событий может быть оценена. Хотя техническая экспертиза необходима для успешного тимуса трансплантации, этот метод обеспечивает уникальную стратегию для изучения в естественных условиях широкий спектр патологий, которые из-за или в результате аномальной функции тимуса и / или гомеостазесть.
Introduction
Тимус является органом, в котором критические события в развитии Т-клеток происходят 1. Резиденты тимоциты, на перестройкой Т-клеточного рецептора (TCR) α и β генов, пройти серию взаимодействий с lymphostromal и антиген-представляющих клеток (APC) в коркового и мозгового регионов тимуса 2. Тимуса позитивной селекции опосредуется корковых эпителиальных клеток тимуса (TEC) для получения тимоцитов, которые распознают антигенные пептиды в контексте принимающей главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и II молекул 2-3. После тимуса влечет за собой негативный отбор очистку аутореактивных тимоцитов, приводимый от взаимодействия с медуллярной TEC или дендритных клеток (ДК), которые представляют пептидов, полученных из собственных белков, связанных с МНС класса I и II молекул 3. Конечным результатом этих процессов является создание пула клеток зрелой CD4 + и CD8 + Т способны реагировать на широкий спектрчужеродных антигенов время экспонирования минимальный реактивность собственных белков 4.
Эффективность тимуса событий отбора зависит от целого ряда факторов, в том числе тимуса созревания, частота мозгового и коркового TEC, подмножества состава тимуса, округ Колумбия, и источник тимуса прекурсоров 3. Следует отметить, что аберрантных тимуса выбор может привести к аутоиммунных 5 или иммунодефицитных патологий, возникающих из нарушенной отрицательной или положительной селекции, соответственно. Молекулярные события, регулирующие тимуса выбор, однако, плохо изучены. В пробирке подходов, таких как перегруппировываться тимуса культур органов (РИПЦ) 6, оказались полезны для анализа основных событий, связанных с вилочковой выбора, но не в полной мере воспроизводят динамику продолжается в естественных событий. В результате, это тимуса трансплантации подход был создан для более событий исследование отбора тимоцитов в естественных условиях 7 </sдо>.
Этот протокол описывает пересадки thymi от новорожденных и взрослых мышей-доноров в иммунодефицитных SCID мышей-реципиентов. Эта методика позволяет исследовать механизмы, которые регулируют положительные и отрицательные тимуса выбор, а также в тимусе различных Т-клеточных подмножеств в онтогенезе. Совсем недавно этот подход был использован, чтобы продемонстрировать, что эффективность отбора тимуса ограничена в ранние сроки после рождения у мышей приводит к увеличению развития аутореактивных Т-клеток, и снижение Т-клеток репертуар специфичен для чужеродных антигенов 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
Riferimenti
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
