Isolering och transplantation av olika Aged Murina tymisk ympkvistar.

Summary

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Abstract

De mekanismer som reglerar effekten av tymisk urval förblir dåligt definierad. Den metod som presenteras här tillåter in vivo analyser av utvecklingen och urval av T-celler specifika för sig själv och främmande antigener. Tillvägagångssättet innebär implantation av tymiska ympkvistar som härrör från olika äldre möss i immundefekta scid mottagare. Under en relativt kort tidsperiod mottagarna är helt upplösta med T-celler som härrör från den implanterade bräss transplantat. Endast tymocyter ympning tymus vid tiden för isolering genomgå selektion och utvecklas till mogna T-celler. Som sådan, kan förändringar i naturen och specificitet ympade T-celler som en funktion av åldersberoende tymiska händelser bedömas. Även om teknisk expertis som krävs för en lyckad thymic transplantation, ger denna metod en unik strategi för att studera in vivo ett brett spektrum av sjukdomar som beror på eller till följd av avvikande tymus funktion och / eller homeostasär.

Introduction

Den bräss är ett organ där kritiska händelser i T-cell utveckling sker ^1. Resident tymocyter vid omlagring av den T-cellreceptor (TCR) α och β gener, genomgå en serie av interaktioner med lymphostromal och antigenpresenterande celler (APC) i de kortikala och medullära regioner av tymus ^2. Tymus positiv selektion förmedlas av kortikala tymiska epitelceller (TEC) för att producera tymocyter som känner igen antigenpeptider i samband med värden större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I- och Il-molekyler ^2-3. Efterföljande tymisk negativ selektion innebär rening av autoreaktiva tymocyter, som drivs av en interaktion med medullär TEC eller dendritiska celler (DC) som presenterar peptider härledda från kroppsegna proteiner som är bundna av MHC klass I och II molekyler ^3. Slutresultatet av dessa processer är inrättandet av en pool av mogna CD4 ⁺ och CD8 ⁺ T-celler kan svara på ett brett spektrumav främmande antigener samtidigt uppvisar minimal reaktivitet mot kroppsegna proteiner ^4.

Effektiviteten av tymiska urvals händelser påverkas av en mängd faktorer, inklusive tymisk mognad, frekvensen av medullär och kortikal TEC, delmängd sammansättningen av tymus DC, och källan till tymiska prekursorer ^3. Särskilt kan avvikande thymic val resultera i autoimmuna ⁵ eller immundefekta sjukdomar, som uppstår av nedsatt negativ eller positiv selektion, respektive. De molekylära händelser som reglerar tymisk val, dock dåligt kända. In vitro metoder såsom reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) ^6, har visat sig vara användbart för att analysera grundläggande händelser i samband med tymisk val, men misslyckas med att fullt ut sammanfatta dynamiken i pågående in vivo-händelser. Som ett resultat, var detta tymisk transplantation baserat tillvägagångssätt inrättas för att bättre händelser studie tymocyt urval in vivo ⁷ </supp>.

Detta protokoll beskriver trans Thymi från nyfödda och vuxna donatormöss i immunodeficienta scid recipientmöss. Denna teknik medger studier av mekanismerna som reglerar positivt och negativt tymisk val, såväl som tymisk produktion av olika T-cellunderuppsättningar under ontogeni. Senast har detta tillvägagångssätt använts för att visa att effektiviteten i thymic val begränsas tidigt efter födseln hos möss leder till ökad utveckling av autoreaktiva T-celler, och en minskad T-cellsrepertoar specifik för främmande antigener ^7.

Protocol

De murina studier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of North Carolina Chapel Hill och alla djuromsorg var i enlighet med de IACUC riktlinjer. 1. Framställning av nyfödda och vuxna Thymi Förbered alla reagenser och utrustning före euthanizing donatormöss. Sterilisera kirurgiska instrument genom autoklavering eller andra lämpliga metoder. Alla kirurgiska ingrepp måste utföras under laminärt flöde huva för att upprätthålla …

Representative Results

Framgången med detta förfarande är beroende på minimalt kirurgiskt trauma samt noggrann positionering av transplantatet under njurkapseln. Den tymisk transplantatet bör klippas för att säkerställa lämplig storlek tymiska sektioner för efterföljande transplantation såsom visas i fig 1. Efter den schematiska i fig 1, kan Thymi från nyfödda eller vuxna möss användas för framgångsrik subkapsulära transplantation med konsekventa och reproducerbara T-celltransplantationsres…

Discussion

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…

Materials

Ethanol	Decon Laboratories	2705HC
PBS	GIBCO	14190-144	pH 7.2
Betadine Solution	Purdue Products	67618-150-17
18 gauge needle	BD	305195
Sutures (1.0 metric)	Ethicon	J493G	18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm)	Clay Adams® Brand	427631
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-20	Sterile, disposable
Mouse anti-CD3 Ab	eBioscience	11-0031-85	Clone: 1452C11
Mouse anti-CD4 Ab	eBioscience	48-0042-82	Clone: RM4-5
Mouse anti-CD8 Ab	eBioscience	25-0081-82	Clone: 53-6.7
Lancet	Medipoint	Goldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	Invitrogen	P30253
96-well round botton polypropylene plates	Corning	3365
1.2mL polypropylene cluster tubes	Corning	4401
5mL polypropylene round-bottom tubes	BD	352002
40uM Nylon Cell Strainer	Falcon	352340
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade	Electron Microscopy Services	15710	Hazardous
Puralube Optical Ointment	Fisher Scientific	NC0138063
Lympholyte	Cedarlane	CL5030
60 mm cell culture dish	Corning	430196	60mm x 15mm, Sterile