लाल रक्त कोशिका एकत्रीकरण के गतिशील जांच के लिए नियंत्रित Microfluidic पर्यावरण
Summary
प्रोटोकॉल इमेज प्रोसेसिंग तकनीक पर आधारित है, विवरण एक नियंत्रित और स्थिर कतरनी दर के तहत लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) समुच्चय यों के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक नियंत्रित microfluidic के वातावरण में इसी कतरनी दर को आरबीसी कुल आकार से संबंधित है।
Abstract
रक्त, एक गैर न्यूटोनियन biofluid के रूप में, hemorheology क्षेत्र में कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित का प्रतिनिधित्व करता है। रक्त घटक लाल रक्त कोशिकाओं, रक्त प्लाज्मा में निलंबित कर रहे हैं कि सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स शामिल हैं। कारण लाल रक्त कोशिकाओं की बहुतायत (रक्त की मात्रा का 40% से 45%) करने के लिए, उनके व्यवहार को विशेष रूप से microcirculation में रक्त की rheological व्यवहार पैदा करती है। बहुत कम कतरनी दरों पर, लाल रक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए देखा जाता है और फार्म संस्थाओं खून की गैर-न्यूटन का व्यवहार का कारण बनता है, जो समुच्चय कहा जाता है। यह microcirculation में रक्त rheology समझने के लिए समुच्चय के गठन की शर्तों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल छवि प्रसंस्करण पर आधारित है, लगातार कतरनी दर के तहत मात्रात्मक microcirculation में आरबीसी समुच्चय निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विवरण है। इस प्रयोजन के लिए, आरबीसी, निलंबन परीक्षण कर रहे हैं और 120 X 60 माइक्रोन पाली डाइमिथाइल-siloxane (PDMS) microchannels में विश्लेषण किया गया। आरबीसी निलंबन ent रहे हैंरक्त परत के भीतर एक रेखीय वेग प्रोफ़ाइल प्राप्त है और इस तरह लगातार कतरनी दरों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्राप्त करने के क्रम में एक दूसरे तरल पदार्थ का उपयोग कर बारिश। आरबीसी समुच्चय एक उच्च गति कैमरे का उपयोग कल्पना कर रहे हैं, जबकि कतरनी दर, एक सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) प्रणाली का उपयोग करते हुए निर्धारित होता है। आरबीसी समुच्चय के कब्जा कर लिया वीडियो छवियों तीव्रता के आधार पर कुल आकार निर्धारित करने के लिए इमेज प्रोसेसिंग तकनीक का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।
Introduction
लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) रक्त की rheological व्यवहार का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे लगभग अकेले इन विट्रो में और vivo में रक्त का विशेष गुण के लिए जिम्मेदार हैं। शारीरिक शर्तों के तहत, लाल रक्त कोशिकाओं रक्त की मात्रा का 40% से 45% पर कब्जा। Microcirculation में, लाल रक्त कोशिकाओं के कारण ही छोटे पोत व्यास और प्रभाव 1 उड़े प्लाज्मा को रक्त की मात्रा का 20% तक कब्जा करना था। Microcirculation में प्लाज्मा कमी की यह घटना Fåhræus प्रभाव के रूप में जाना जाता है। कम कतरनी दरों पर, लाल रक्त कोशिकाओं इसलिए खून की गैर-न्यूटन का व्यवहार करने के लिए योगदान, एक साथ पाटने और "rouleaux" या समुच्चय बुलाया आयामी एक या एक से तीन आयामी संरचना बनाने में सक्षम हैं। हालांकि, आरबीसी एकत्रीकरण का तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है। दो सिद्धांतों लाल रक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण मॉडल करने के लिए मौजूद हैं: कोशिकाओं सिद्धांत का सेतु की वजह से बड़े अणुओं 2 के पार से जोड़ने और बल आकर्षक करने के लिएtion के सिद्धांत के कारण आसमाटिक ढाल से 3 अणुओं की कमी की वजह से।
आमतौर पर, मानव रक्त के लिए, समुच्चय 1 से 10 सेकंड -1 को लेकर बहुत कम कतरनी दरों 4 बजे के रूप में। इस सीमा से ऊपर, लाल रक्त कोशिकाओं disaggregate और पोत के भीतर अलग से प्रवाह के लिए करते हैं।
समुच्चय के गठन की शर्तों को समझना रक्त का रियोलॉजिकल व्यवहार को परिभाषित करने के मामले में hemorheology क्षेत्र के लिए एक बहुत महत्व का है। ये समुच्चय अक्सर macrocirculation स्तर (> 300 माइक्रोन व्यास) 5 पर देखा जाता है। इस पैमाने पर, रक्त एक न्यूटोनियन तरल पदार्थ और एक समरूप मिश्रण के रूप में माना जाता है। हालांकि, इन समुच्चय शायद ही कभी केशिका स्तर (व्यास में 4-10 माइक्रोन) में देखा जाता है और आम तौर पर इस तरह के मधुमेह 6 और मोटापे के रूप में रोग की स्थिति का संकेत कर रहे हैं। आरबीसी एकत्रीकरण भड़काऊ या संक्रामक शर्तें शामिल बदल सकता है कि अन्य रोग की स्थिति,ऐसे उच्च रक्तचाप या atherosclerosis, आनुवंशिक विकारों और पुराने रोगों के रूप में 7 हृदय रोगों। इसलिए, आरबीसी एकत्रीकरण तंत्र को समझने और (इन समुच्चय और प्रवाह की स्थिति के आकार के बीच एक संबंध को परिभाषित द्वारा) इन संस्थाओं का विश्लेषण करने के खून की microrheological व्यवहार को समझने के लिए ले जा सकता है और इसलिए नैदानिक आवेदन करने के लिए संबंधित हैं।
आरबीसी समुच्चय ऐसे हेमाटोक्रिट (रक्त में लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा), कतरनी दर, पोत व्यास, आरबीसी झिल्ली कठोरता और निलंबित मध्यम रचना 8-10 के रूप में कई कारकों से बदला जा सकता है। इसलिए, नियंत्रित परिस्थितियों को प्रभावी ढंग से आरबीसी समुच्चय का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं। कई तरीकों रक्त व्यवहार के बारे में प्रासंगिक जानकारी प्रदान करता है कि स्थिर एकत्रीकरण माप (एकत्रीकरण सूचकांक) उपलब्ध कराने के द्वारा कुल गठन का विश्लेषण करने में सक्षम हैं। इन विधियों, अन्य बातों के साथ, एरिथ्रोसाइट अवसादन दर शामिलविधि 11, प्रकाश संचरण विधि 12, प्रकाश प्रतिबिंब विधि 13 और कम कतरनी चिपचिपापन विधि 14।
कुछ अध्ययनों आरबीसी एकत्रीकरण का अध्ययन करने और नियंत्रित प्रवाह की स्थिति 15-17 में एकत्रीकरण की डिग्री का निर्धारण करने का प्रयास किया। हालांकि, इन अध्ययनों से परोक्ष रूप से एकत्रीकरण की डिग्री के साथ ही स्थानीय चिपचिपाहट के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के सूक्ष्म रक्त छवियों के आधार पर मापा जाता है एक बाल काटना प्रणाली में कब्जा अंतरिक्ष के अनुपात का निर्धारण करके आरबीसी कुल आकार की जाँच।
इसलिए हम सीधे आरबीसी नियंत्रित और स्थिर कतरनी दरों के तहत, गतिशील, microcirculation में समुच्चय यों के लिए एक नई प्रक्रिया को प्रस्तुत करते हैं। एक बफर फॉस्फेट (पीबीएस) खारा समाधान इसलिए रक्त परत में एक कतरनी प्रवाह पैदा करने के साथ, (चित्रा 1 में सचित्र के रूप में) आरबीसी निलंबन एक डबल वाई-microchannel में, entrained कर रहे हैं। इस रक्त के भीतर एक निरंतर एक प्रकार का वृक्ष परतआर दर प्राप्त की जा सकती है। आरबीसी निलंबन अलग हेमाटोक्रिट (एच) के स्तर (5%, 10% और 15%) में और अलग अलग कतरनी दर (2-11 सेकंड -1) के तहत जांच की जाती है। रक्त वेग और कतरनी दर प्रवाह एक उच्च गति कैमरे का उपयोग कर कल्पना की है, जबकि एक सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) प्रणाली का उपयोग करते हुए निर्धारित कर रहे हैं। प्राप्त परिणामों तो लाल रक्त कोशिकाओं का पता लगाने और कुल आकार निर्धारित करने के लिए छवि तीव्रता के आधार पर एक MATLAB कोड के साथ कार्रवाई कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान पद्धति का प्रयोग, यह गुणात्मक विश्लेषण करने के लिए संभव है और मात्रात्मक आरबीसी अलग प्रवाह की स्थिति और hematocrits तहत समुच्चय। सफल परीक्षण और कुल का पता लगाने के लिए, यह microchannel के प्रवेश पर दो तरल पदार?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थित किया गया। Microfabrication मैकगिल विश्वविद्यालय में मैकगिल Nanotools MicroFab सुविधा और कार्लटन विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रानिक्स विभाग के सहयोग से किया गया था।
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
Riferimenti
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