Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation
Summary
Het protocol beschreven gegevens een experimentele procedure om rode bloedcel (RBC) aggregaten kwantificeren onder gecontroleerde en constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerkingstechnieken. Het doel van dit protocol is het RBC totale afmetingen naar de desbetreffende afschuifsnelheid in een gecontroleerde omgeving microfluidic.
Abstract
Bloed, als niet-Newtoniaanse Biofluid vertegenwoordigt de focus van talrijke studies op het gebied hemorheology. Bloedcomponenten omvatten rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes die zijn gesuspendeerd in bloedplasma. Vanwege de overvloed van de erytrocyten (40% tot 45% van het bloedvolume), hun gedrag dicteert de reologische gedrag van bloed vooral in de microcirculatie. Bij zeer lage afschuifsnelheden worden beschouwd RBC's te assembleren en maken entiteiten genoemd aggregaten, waarbij de niet-Newtons gedrag van bloed veroorzaakt. Het is belangrijk de omstandigheden van de vorming van aggregaten begrijpen om de bloedreologie microcirculatie begrijpen. De hier beschreven protocol beschrijft de experimentele procedure om kwantitatief bepalen van de RBC aggregaten in de microcirculatie onder constante afschuifsnelheid, gebaseerd op beeldverwerking. Hiervoor zijn RBC-suspensies beproefd en 120 x 60 urn poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) microkanalen geanalyseerd. De RBC-schorsingen zijn entgeregend gebruik van een tweede fluïdum om een lineair snelheidsprofiel in het bloed laag te verkrijgen en daarmee ook de uiteenlopende constante afschuifsnelheden. De afschuifsnelheid wordt bepaald met behulp van een micro Particle Image Velocimetry (μPIV) systeem, terwijl RBC aggregaten worden gevisualiseerd met behulp van een high speed camera. De videoclips die van de RBC aggregaten geanalyseerd met beeldverwerkingstechnieken teneinde de totale weergegeven gebaseerd op de beelden intensiteit te bepalen.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC) spelen een cruciale rol bij het bepalen van de rheologische gedrag van bloed. Zij zijn bijna singulier verantwoordelijk voor de specifieke eigenschappen van bloed in vitro en in vivo. Onder fysiologische omstandigheden, RBCs bezetten 40% tot 45% van het bloedvolume. In microcirculatie, RBCs alleen bezet tot 20% van het bloedvolume gevolg van kleinere diameters vaartuig en het plasma skimming effect 1. Dit fenomeen van een plasma vermindering microcirculatie bekend als Fåhræus effect. Bij lage afschuifsnelheden, RBCs samen kunnen overbruggen en vormen ééndimensionale of driedimensionale structuren genaamd "rouleaux" of aggregaten beperken, waardoor de niet-Newtons gedrag van bloed. Echter, het mechanisme van aggregatie RBC niet volledig begrepen. Twee theorieën bestaan om het model van de aggregatie van RBC: het overbruggen van cellen theorie te wijten aan de verknoping van de macromoleculen 2 en de kracht attractie theorie veroorzaakt door afbraak van de moleculen als gevolg van de osmotische gradiënt 3.
Kenmerkend voor menselijk bloed, aggregaten bij zeer lage afschuifsnelheden 4 variërend van 1 tot 10 sec -1. Boven deze range, RBC's hebben de neiging om te splitsen en stromen afzonderlijk in het vat.
Inzicht in de voorwaarden van de aggregaten formatie is van groot belang om het veld hemorheology in termen van het bepalen van rheologische gedrag van bloed. Deze aggregaten worden vaak gezien op de macrocirculatie niveau (> 300 urn diameter) 5. Op deze schaal wordt bloed beschouwd als een Newtonse vloeistof en een homogeen mengsel. Echter, deze aggregaten zelden in het capillaire niveau (4-10 um in diameter) en die meestal een indicatie van pathologische aandoeningen zoals diabetes en obesitas 6. Andere pathologische omstandigheden dat kan veranderen RBC aggregatie omvatten inflammatoire of infectieuze aandoeningen,cardiovasculaire aandoeningen zoals hypertensie en atherosclerose, genetische aandoeningen en chronische ziekten 7. Daarom is het begrijpen van de RBC aggregatiemechanisme en analyse van deze entiteiten (door het definiëren van een relatie tussen de grootte van deze aggregaten en stromingsomstandigheden) kunnen leiden tot het begrijpen van het gedrag van microrheological bloed en daarmee verband aan klinische toepassingen.
RBC aggregaten worden veranderd door verscheidene factoren zoals de hematocriet (volume RBC's in het bloed), de afschuifsnelheid, de vaatdiameter, de RBC membraan stijfheid en het suspenderende medium preparaat 8-10. Daarom zijn gecontroleerde omstandigheden vereist om effectief te analyseren RBC aggregaten. Verschillende methoden zijn in staat om aggregaatvorming analyseren door het verstrekken van statische aggregatie metingen (aggregatie index) dat relevante informatie over bloed gedrag biedt. Deze methoden omvatten, onder meer, de bezinkingmethode 11, de lichttransmissie methode 12, de lichtreflectie methode 13 en de lage afschuifviscositeit methode 14.
Weinig studies hebben geprobeerd om RBC aggregatie bestuderen en bepalen de mate van aggregatie in gecontroleerde stroom omstandigheden 15-17. Echter, deze studies indirect onderzoek RBC totale afmetingen door bepaling van de verhouding van de verblijfsruimte in een knipsysteem gemeten op basis van bloed microscopische beelden met informatie over de mate van aggregatie en de lokale viscositeit.
We stellen daarom een nieuwe procedure om direct te kwantificeren RBC aggregaten in microcirculatie, dynamisch, onder gecontroleerde en constante shear tarieven. RBC-suspensies worden meegevoerd in een dubbele Y-microkanaal (zie figuur 1), met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing dus waardoor een schuifkracht in het bloed laag. Binnen dit bloed laag een constante shear tarief kan worden verkregen. De RBC-suspensies worden getest bij verschillende hematocriet (H) niveau (5%, 10% en 15%) en bij verschillende afschuifsnelheden (2-11 sec -1). Het bloed snelheid en afschuifsnelheid worden bepaald met behulp van een micro Particle Image Velocimetry (μPIV) systeem, terwijl de stroom wordt gevisualiseerd met behulp van een high speed camera. De verkregen resultaten worden vervolgens verwerkt met een MATLAB code op basis van de afbeeldingintensiteiten om de RBC's te detecteren en te bepalen totale afmetingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de onderhavige werkwijze is het mogelijk om kwalitatief en kwantitatief analyseren RBC aggregaten onder verschillende stroomomstandigheden en hematocriet. Voor uitvoering van de controle en geaggregeerde detectie, is het cruciaal om de juiste snelheidsverhouding tussen de twee fluïda te bepalen bij het microkanaal ingang. Deze verhouding is belangrijk voor een optimale dikte bloed laag waar het snelheidsprofiel quasi-lineair 19 verkrijgen.
Een andere belangrijke factor voor e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. Microfabricage werd uitgevoerd met de steun van de McGill nanotools Microfab faciliteit aan de McGill University en de vakgroep Elektronica aan Carleton University.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
Riferimenti
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. . Red Blood Cell Aggregation. , (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. . Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
