We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
सर्किट excitability की कोलीनर्जिक मॉडुलन अनुभूति के बुनियादी पहलुओं के लिए योगदान देता है, और बदल कोलीनर्जिक मॉडुलन अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, मानसिक असंतुलन और नशे की लत 1-4 सहित neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों की एक विशेषता है। सीएनएस में synaptic प्रसारण की कोलीनर्जिक सुविधा की स्थापना की एक तंत्र पूर्व synaptic स्थलों पर स्थानीयकृत nAChRs के प्रत्यक्ष सक्रियण के माध्यम से है। परोक्ष रूप से कुछ nAChR उपप्रकार है, और के अपेक्षाकृत उच्च कैल्शियम प्रवाहकत्त्व को सीधे दोनों की वजह से होकर इंट्रासेल्युलर संकेत Cascades – इन पूर्व synaptic रिसेप्टर्स की सक्रियण इंट्रासेल्युलर सीए 2 + ([सीए 2 +] मैं) पूर्व synaptic टर्मिनलों में वृद्धि करने के लिए सुराग 5, जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज बढ़ाने के। वास्तव में, पूर्व synaptic nAChRs की सक्रियता ग्लूटामेट सहित न्यूरोट्रांसमीटर की एक विस्तृत विविधता, गाबा, ACH, की रिहाई में परिवर्तन के साथ जोड़ा गया है एकएन डी डोपामाइन 6-10। इस प्रक्रिया को परोक्ष रूप से विभिन्न synapses पर electrophysiological विधियों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, के ऑप्टिकल संवाददाताओं [सीए 2 +] मैं और synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग पूर्व synaptic घटना की अधिक प्रत्यक्ष और अस्थायी सटीक माप अनुमति देते हैं।
NAChRs की पूर्व synaptic स्थानीयकरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म (ईएम) स्तर 11,12 पर nAChRs के प्रत्यक्ष इम्युनो सोने की लेबलिंग के साथ आसानी से प्रदर्शन किया गया है। कई अन्य तकनीकों का भी सभ्य न्यूरॉन्स 13,14 में nAChRs subunit- फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा के स्थानों का पता लगाने सहित, परोक्ष रूप से nAChR स्थानीयकरण संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों 15,16 में nAChR धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग, [में सीए निकोटीन प्रेरित परिवर्तन की निगरानी द्वारा synaptic टर्मिनल पर लाइव सेल इमेजिंग 17, और neurotransmitter रिहाई के अप्रत्यक्ष निगरानी द्वारा अन्तर्ग्रथनी तंत्रिका टर्मिनलों में 2 +] मैंstyryl amphipathic एफएम रंजक (FM1-43 और FM4-64) और / या synapto-pHluorin द्वारा और इस तरह के ग्लूटामेट के लिए ACH और iGluSnFr के लिए CNiFERs के रूप में विशिष्ट फ्लोरोसेंट न्यूरोट्रांसमीटर संवाददाताओं ने देखा synaptic vesicles के एक्सोसाइटोसिस सहित फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ लाइव सेल इमेजिंग तकनीक, 18-20। कुल मिलाकर, nAChRs की पूर्व synaptic स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए इन वर्तमान दृष्टिकोण जटिल कर रहे हैं, और विश्वसनीय पहचान और पूर्व synaptic गतिविधि के शारीरिक निगरानी की अनुमति देने के लिए विशेष व्यवस्था और तकनीक की आवश्यकता है।
की पहचान करने और synaptic प्रसारण के पूर्व और बाद synaptic घटकों दोनों का विश्लेषण करने के लिए सीधी पहुँच प्रदान करता है कि नाभिक accumbens (nAcc) सर्किट – यहाँ हम एक उदर हिप्पोकैम्पस (vHipp) की एक में इन विट्रो सह संस्कृति प्रणाली के लिए प्रोटोकॉल और उपकरणों का वर्णन है। हम पूर्व synaptic nAChRs के स्थानीयकरण और सीए 2 + संकेतन और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज alo मध्यस्थता nAChR का जीना सेल इमेजिंग के उदाहरण दिखानेएनजी vHipp एक्सोन। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक प्राकृतिक (और सीधा) विस्तार अलग जीनोटाइप से न्यूरॉन्स के शामिल पूर्व और बाद synaptic संपर्कों की तैयारी है। इस तरीके में मॉडुलन के पूर्व और / या बाद synaptic तंत्र के लिए एक विशेष जीन उत्पाद के योगदान को सीधे मूल्यांकन किया जा सकता है।
सह संस्कृति तैयारी वर्णित फिर से capitulates इन विट्रो में उदर हिप्पोकैम्पस accumbens सर्किट। पूर्व synaptic nAChRs की सक्रियता glutamatergic संचरण 5, 21 बढ़ाया प्रकाश में लाना है जिसके द्वारा स्थानिक और लौकिक प्रोफाइल के ?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
1, Culture Media (50 ml) | |||
Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |