Summary

Live-Imaging av nikotin Induced Kalsium alarm og neurotransmitterfrigivning Sammen ventral Hippokampale Axoner

Published: June 24, 2015
doi:

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Kolinerge modulering av kretsen oppstemthet bidrar til grunnleggende aspekter av kognisjon, og endret kolinerge modulasjon er en funksjon av nevrodegenerative og nevropsykiatriske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, schizofreni og avhengighet 1-4. En etablert mekanisme av kolinerge tilrettelegging av synaptisk transmisjon i CNS er via direkte aktivering av nAChR lokaliserte på presynaptiske nettsteder. Aktivering av disse pre-synaptiske reseptorer fører til økt intracellulær Ca 2 + ([Ca2 +] i) i presynaptiske terminaler – både direkte, på grunn av det relativt høye kalsium konduktansen av visse nAChR undertyper, og indirekte, via intracellulære signalkaskader 5, og dermed forbedre neurotransmitterfrigjørelse. Faktisk har aktiveringen av pre-synaptiske nAChR vært knyttet til endringer i frigjøring av en rekke neurotransmittere, inkludert glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin 6-10. Selv om denne prosessen har vært undersøkt ved hjelp av indirekte metoder på forskjellige elektrofysiologiske synapser, optiske meldere av [Ca2 +] og gjenvinning av synaptiske vesikler tillate mer direkte og timelig nøyaktig måling av presynaptiske fenomener.

Pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er er blitt vist overbevisende med direkte immuno-gull merking av nAChR-er ved elektronmikroskopi (EM) nivå 11,12. Flere andre teknikker har også blitt brukt til å adressere nAChR lokalisering indirekte, herunder å detektere plasseringen av nAChR-subunit- fluorescerende protein-kimeras i dyrkede nerveceller 13,14, elektro opptak av nAChR strømmer i synaptiske terminaler 15,16, overvåking nikotin induserte endringer i [Ca 2+] i som synaptiske nerveterminaler av levende celle bildebehandling 17, og indirekte overvåking av neurotransmitterfrigivning på den synaptiske terminalen vedlevende celle imaging teknikker med fluorescerende indikatorer, inkludert eksocytose av synaptiske vesikler så etter styryl amphipathic FM fargestoffer (FM1-43 og FM4-64) og / eller synapto-pHluorin og ved spesifikke fluorescerende neurotransmitter reportere, som CNiFERs for ACH og iGluSnFr for glutamat 18-20. Samlet disse nåværende fremgangsmåter for identifisering av pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er kompliserte, og krever spesielle systemer og teknikker for å tillate pålitelig identifisering og overvåkning av fysiologiske pre-synaptisk aktivitet.

Her beskriver vi protokoller og utstyr for en in vitro co-kultur system av en ventral hippocampus (vHipp) – nucleus accumbens (NACC) krets som gir direkte tilgang til å identifisere og analysere både pre- og postsynaptiske komponenter av synaptisk overføring. Vi viser eksempler på presynaptisk lokalisering av nAChR og live cell imaging av nAChR mediert Ca 2+ signal- og neurotransmitterfrigivning along vHipp aksoner. En naturlig (og grei) forlengelse av protokollen som presenteres her er utarbeidelsen av pre- og postsynaptiske kontakter består av nerveceller fra ulike genotyper. På denne måte bidrag av et spesielt genprodukt til pre- og / eller post-synaptiske mekanismer for modulering kan måles direkte.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjoner nr 80-23, revidert 2012) og studier ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk for forskningsutvalget ved Stony Brook University (# 1618 og # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Co-kulturer Offer mus (postnatal dag 0 – 3, fra villtype (WT) eller α7 nAChR transgen muse linje) med CO 2. Halshogge hver valp og lagre halen i en 1,5 ml sentrif…

Representative Results

Utarbeidelse ansatt består av genet kimerisk co-kulturer av vHipp-NACC kretser in vitro. Anslag kommer fra vHipp microslices, som presynaptiske axonal innspill, kan gjøre synaptiske kontakter med postsynaptiske mål, de spredte nerveceller fra NACC. Nikotin induserte en vedvarende (≥ 30 min) tilrettelegging av glutamatergic overføring fra NACC nevroner innerverte av vHipp axoner 21 og langvarig kalsium signale sammen vHipp axoner 5 via presynaptiske α7 * nAChR. <p class="jove_con…

Discussion

Utarbeidelse co-kultur beskrevet re-kapitulerer ventral hippocampus-accumbens kretser in vitro. Dette preparatet tillatelser relativt enkel og pålitelig undersøkelse av romlige og tidsmessige profiler der aktivering av presynaptiske nAChR framprovosere forbedrede glutamaterg girkasse 5, 21.

Ko-kulturer er definert som veksten av forskjellige spesifikke celletyper i en skål som kan gi fysiologiske betingelser in vitro for å demonstrere in vivo-lignende</em…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.

Materials

1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

Riferimenti

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O’Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. . Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
check_url/it/52730?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

View Video