Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Cholinergic modulering av kretsen retbarhet bidrar till grundläggande aspekter av kognition, och förändrat kolinerga modulering är en funktion av neurodegenerativa och neuropsykiatriska störningar, inklusive Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, schizofreni och missbruk ^1-4. En etablerad mekanism för kolinerga underlättande av synaptisk transmission i CNS är via direkt aktivering av nAChRs lokaliserade vid presynaptiska webbplatser. Aktivering av dessa presynaptiska receptorer leder till ökad intracellulär Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+] _i) i presynaptiska terminaler – både direkt, på grund av den relativt höga kalcium konduktansen hos vissa nAChR-subtyper, och indirekt, via intracellulära signaleringskaskader ^5, och därigenom öka neurotransmittorfrisättning. I själva verket har aktiveringen av presynaptiska nAChRs kopplats till förändringar i frisättning av ett stort antal olika signalsubstanser inklusive glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin ^6-10. Även om denna process har studerats indirekt med hjälp av elektrofysiologiska metoder vid olika synapser, optiska reportrar i [Ca2 ^+] _i och synaptiska vesikler återvinning möjliggöra mer direkt och tidsmässigt exakt mätning av presynaptiska företeelser.

Pre-synaptiska lokalisering av nAChRs har visats på ett övertygande sätt med direkt immun guld märkning av nAChRs på elektronmikroskopiska (EM) nivå ^11,12. Flera andra tekniker har också använts för att behandla nAChR lokalisering indirekt, inklusive detektering placeringarna av nAChRs subunit- fluorescerande proteinchimärer i odlade neuroner ^13,14, elektrofysiologiska inspelning av nAChR-strömmar i synaptiska ändarna ^15,16, övervakning nikotin inducerade förändringar i [Ca ^{2 +]} _i i synaptiska nervterminaler efter levande cell imaging ^17, och indirekt kontroll av neurotransmittorfrisättning vid synaptiska terminalen genomlevande cell avbildningstekniker med fluorescerande indikatorer, däribland exocytos av synaptiska vesiklar ses av styrylfärgämnen amfipatiska FM färgämnen (FM1-43 och FM4-64) och / eller synapto-pHluorin och specifika fluorescerande signalsubstans reportrar, såsom CNiFERs för ACh och iGluSnFr för glutamat ^18-20. Sammantaget dessa aktuella metoder för att identifiera presynaptisk lokalisering av nAChRs är komplicerade och kräver särskilda system och tekniker för att möjliggöra säker identifiering och fysiologisk övervakning av presynaptisk aktivitet.

Här beskriver vi protokoll och utrustning för ett in vitro samodlingssystemet av en ventrala hippocampus (vHipp) – nucleus accumbens (NACC) krets som ger direkt tillgång till kartlägga och analysera både före och postsynaptiska komponenter i synaptisk transmission. Vi visar exempel på presynaptisk lokalisering av nAChRs och levande cell imaging av nAChR medierad Ca2 ⁺ signalering och neurotransmittorfrisättning along vHipp axoner. En naturlig (och enkelt) förlängning av protokollet presenteras här är framställningen av före och efter synaptiska kontakter som består av nervceller från olika genotyper. På detta sätt kan bedömas bidraget av en viss gen produkt till för- och / eller postsynaptiska mekanismer moduleringen direkt.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH publikationerna nr 80-23, reviderad 2012) och undersökningar har godkänts av Institutional Animal Care och användning för forskning kommittéer vid Stony Brook University (# 1618 och # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Samkulturer Sacrifice möss (postnatal dag 0 – 3 från vildtypen (WT) eller α7 nAChRs transgen mus linje) med CO2. Halshugg…

Representative Results

Beredningen användes består av gen chimär samkulturer av vHipp-NACC kretsar in vitro. Prognoser som härrör från vHipp microslices, som presynaptisk axonal ingång, kan göra synaptiska kontakter med postsynaptiska mål, de spridda neuroner från NACC. Nikotin framkallade en ihållande (≥ 30 min) underlättande av glutamaterg överföring från NACC nervceller innerverade av vHipp axoner 21 och långvarig kalcium signalering längs vHipp axoner 5 via presynaptisk α7 * nAChRs. <…

Discussion

Det co-kultur preparat som beskrivs åter kapitulerar ventrala hippocampus-accumbens kretsar in vitro. Detta möjliggör en relativt enkel och tillförlitlig undersökning av rumsliga och tidsmässiga profiler genom vilka aktivering av presynaptiska nAChRs framkalla förbättrade glutamaterg transmission ^{5, 21.}

Samodlingar definieras som tillväxten av olika specifika celltyper i en maträtt som kan ge fysiologiska betingelser in vitro för att demonstrera in…

Materials

			1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
			2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
			3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
			5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM