En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

Summary

activation de cellules microgliales et microgliose sont des réponses clés à la neurodégénérescence chronique. Ici, nous présentons les méthodes pour in vivo, la visualisation à long terme de la rétine CX3CR1-GFP + cellules microgliales par ophtalmoscopie confocale, et pour le seuil et analyses morphométriques d'identifier et de quantifier leur activation. Nous surveillons changements microgliales durant les premiers stades de glaucome liée à l'âge.

Abstract

Microglie, qui sont des cellules neuro SNC-résidents, transforment leur morphologie et la taille en réponse aux dommages CNS, le passage à un état activé avec des fonctions distinctes et les profils d'expression génique. Les rôles de l'activation de la microglie dans la santé, les blessures et la maladie restent encore mal compris en raison de leur régulation dynamique et complexe en réponse à des changements dans leur microenvironnement. Il est donc essentiel de surveiller de manière non invasive et analyser des changements dans l'activation microgliale au fil du temps dans l'organisme intact. Des études in vivo de l'activation de la microglie ont été retardés par des limitations techniques de suivi du comportement des microglies sans altérer l'environnement CNS. Cela a été particulièrement difficile pendant la neurodégénérescence chronique, où les changements à long terme doivent être suivis. La rétine, un organe CNS prêtent à l'imagerie en direct non-invasive, offre un puissant système de visualiser et de caractériser la dynamique de l'activation de la microglie lors de troubles chroniques.

<p class = "jove_content"> Ce protocole décrit les méthodes de longue durée, l'imagerie in vivo de la rétine de la microglie, en utilisant ophtalmoscopie confocale (ALSC) et souris ^{/ +} rapporteurs CX3CR1 ^GFP, de visualiser la microglie avec une résolution cellulaire. Aussi, nous décrivons des méthodes pour quantifier les changements mensuels dans l'activation des cellules et de la densité dans les grands sous-ensembles de cellules (200-300 cellules par la rétine). Nous confirmons l'utilisation de la zone de autosomique une mesure utile pour le suivi en direct de l'activation de la microglie dans la rétine en appliquant automatisé analyse morphométrique basé sur un seuil d'images in vivo. Nous utilisons ces acquisition d'images en direct et des analyses des stratégies pour surveiller les changements dynamiques dans l'activation de la microglie et microgliose durant les premiers stades de la neurodégénérescence rétinienne dans un modèle de souris du glaucome chronique. Cette approche devrait être utile pour enquêter sur les contributions de la microglie à baisse neuronale et axonale dans les troubles chroniques du système nerveux central qui affectent la rétine et du nerf optique.

Introduction

Ces cellules microgliales neuroimmunes qui résident exclusivement dans le système nerveux central (SNC), depuis le développement embryonnaire précoce et tout au long de l'âge adulte. Equipé d'un répertoire complexe de récepteurs, l'activité de la microglie et l'hétérogénéité régionale sont régies par leur interaction bidirectionnelle avec les neurones voisins, gliales, barrière hémato-encéphalique et infiltrant les cellules neuro-inflammatoires ^1,2. Fonctions microgliales basales contribuent à l'entretien et la réparation physiologique, comme ils échantillonnent leur territoire pour des perturbations de l'homéostasie ^3,4. Pendant une lésion du SNC ou de la maladie, les microglies sont les premiers intervenants à des signaux neuronaux qui déclenchent alors leur transition vers un phénotype réactif, appelé "activé microglie ^2,5-7. l'activation de la microglie implique un cycle complexe de gènes et expression de la protéine, qui sont couplés à soma des cellules et processus de redimensionnement et le remodelage ^6-9. activation de cellules microgliales, ainsi que la redistribution de la cellule etclustering, peut être accompagnée de l'augmentation globale locale dans le nombre de cellules (de microgliose appelé). Cela peut résulter de la prolifération cellulaire et l'auto-renouvellement, avec ou sans le recrutement de monocytes dérivés du sang ^3,4,7,10-14. Dans un large éventail de maladies du SNC, chroniques dépendant de l'âge, soutenue microgliose et l'activation de la microglie maladie parallèle progression ^15-19. Comment microglie l'impact neurodégénérescence reste incertaine, principalement parce qu'ils jouent deux rôles neuroprotecteurs et délétères qui peuvent avoir diverses contributions à l'apparition et la progression de la maladie. Études d'imagerie en direct visant à comprendre la maladie chronique du système nerveux central ont surveillé le comportement de la microglie dans le SNC endommagé des modèles animaux et des humains, et a démontré que des altérations microgliales sont début détectable à des stades précoces de la maladie ^15-17,19,20. Ainsi, il est essentiel de développer des approches pour détecter et surveiller l'activation des microglies in vivo.

Dete non-invasivection des changements régionaux dans l'activation des microglies du cerveau a été créé comme un indicateur important dans vivo de progression de la maladie neurodégénérative, en utilisant l'imagerie moléculaire ou bioluminescence et la tomographie par émission de positons ou imagerie par résonance magnétique ^18,21,22. Ces méthodes d'imagerie moléculaire et nucléaire hautement quantitatives et non invasives détectent gliose avec une résolution régionale. Alternativement, deux photons imagerie confocale en CX3CR1 ^{GFP / +} souris a permis l'observation de la microglie du cerveau avec une résolution cellulaire ^{3,4,9,20,23-28.} Cependant, cette approche limite à long terme et l'observation répétée d'altérations microgliales chroniques, étant donné le risque potentiel de perturber leur comportement par des procédures d'imagerie cérébrale, même minimalement invasives ^29. Alternativement, la rétine offre des conditions optimales pour la visualisation directe, dans vivo et la surveillance répétée de la microglie dans leur niche CNS intact tout au long vieillissement, suite à une blessure aiguë, etpotentiellement au cours de maladies neurodégénératives chroniques. Ainsi, des études récentes ont prouvé la faisabilité d'imagerie à haute résolution de la microglie rétiniennes exprimant la GFP en adaptant la ophtalmoscopie confocale à balayage laser (ALSC) à l'image en direct CX3CR1 ^GFP de souris ^{/ +.} Cela a été utilisé pour suivre les variations hebdomadaires GFP + cellulaires numéros dans les souris individuelles pour un maximum de 10 semaines après une lésion aiguë induite ou d'hypertension oculaire ^30-36.

Nous avons étendu cette approche pour réaliser une imagerie à long terme sur plusieurs mois, et de suivre quantitativement les changements dans l'activation de la microglie basés sur la taille de soma en utilisant une analyse morphométrique. Somal taille a été définie comme une mesure utile de l'activation de la microglie dans les études d'imagerie en direct à deux photons en utilisant la microscopie confocale en tranches corticales pour effectuer l'imagerie in vivo de CX3CR1-GFP + ⁹ microglie. Ces et d'autres études ont également démontré la corrélation entre la taille de autosomique et les niveaux d'expression de la protéine Iba1, which augmente également avec l'activation ^9,37. Ainsi, la microglie activée peut être identifiée dans des souris vivantes, et leur nombre et leur répartition contrôlée dans le temps au cours de la santé et de la maladie du SNC.

Ce protocole décrit des méthodes pour ALSC acquisition d'images en direct et d'analyse pour surveiller le nombre de cellules microgliales, la distribution et l'activation morphologique au cours cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) de la dégénérescence (Figure 1). Ainsi, cette étude utilise: 1) un modèle de souris du glaucome héréditaire (DBA / 2J) qui subit dépend de l'âge du nerf optique et de la neurodégénérescence rétinienne et présente une variabilité remarquable progression de la maladie entre 5 et 10 mois de ^38,39 ans, 2) mois ALSC imagerie in vivo pour la visualisation à long terme de cellules GFP + dans la rétine et du nerf optique non myélinisées de hétérozygotes CX3CR1 ^{GFP / +} DBA / 2J souris âgées de 3 à 5 mois, 3) en temps réel une analyse de formation d'image par segmentation et d'un seuil pour isoler des corps cellulaires des cellules et mesure lazone ir. Ces stratégies sont appliquées pour évaluer la cinétique de états d'activation de la microglie rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique.

Protocol

Imagerie in vivo est effectuée dans des installations exemptes d'agents pathogènes en utilisant des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de l'Utah. Remarque: Ce protocole d'imagerie est utilisé pour des souris rapporteurs dans lequel la microglie rétiniennes et les monocytes / macrophages infiltrants expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du locus du récepteur de la fractalkine…

Representative Results

Nos récentes études in vivo ont utilisé ces méthodes d'acquisition et d'analyse d'image en direct de visualiser et de suivre la cinétique et les modèles de ONH et les changements microgliales rétiniennes durant les premiers stades de glaucome chronique et leur relation à la fin de la neurodégénérescence 59. Ici, nous illustrons un protocole d'acquisition d'image ALSC pour visualiser les cellules microgliales sur une grande surface de la rétine centrale dans les différ…

Discussion

Le suivi direct du nombre de cellules de la microglie et morphologique au cours de l'activation d'une maladie neurodégénérative nécessite l'utilisation de procédés d'imagerie non invasifs permettant la visualisation détaillée des caractéristiques de la cellule. Après l'imagerie, les cellules microgliales doivent être isolés (segmenté) pour l'analyse morphométrique par l'utilisation de plusieurs étapes de seuil pour évaluer la taille de autosomique et / ou de la complexité des…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	000671 and 00582	Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe	BD, East Rutherford, NJ	305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T48402, 152463 and P4417	Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump	Gaymar Industries, Orchard Park, NY	TP-650
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	23-400-100
Tropicamide 1%	Bausch & Lomb, Rochester, NY	NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center	Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK	G003709	Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software	Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA	Version 1.7.1.0
PowerPoint	Microsoft, Redmond, WA	Version 14.4.3
Adobe Photoshop	Adobe, San Jose, CA	Version CS3
FluoRender	Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah	Version 2.13	Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C	Nikon, Melville, NY	Version 4.30.01