Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
I ryggradsdjur är hematopoies regleras av induktiva mikromiljöer (nischer). På samma sätt, i ryggradslösa modellorganism Drosophila melanogaster, induktiva mikromiljöer som kallas larv Hematopoietic Fickor (HPs) har identifierats som anatomiska platser för utveckling och reglering av blodkroppar (hemocyter), i synnerhet självförnyande makrofag härkomst. HPs är segment upprepade fickor mellan epidermis och muskelskikt av larven, som också innefattar sensoriska neuroner i det perifera nervsystemet. I larven är bosatta (fastsittande) hemocyter utsätts för anti-apoptotiska, lim och proliferativa signaler från dessa sensoriska neuroner och eventuellt andra komponenter i HPs, såsom foder muskler och epitelceller skikt. Under normal utveckling, gradvis frisättning av inhemska hemocyter från HPs bränslen befolkningen i cirkulerande hemocyter, som kulminerar i utgivningen av most för de inhemska hemocyter i början av metamorfos. Immun övergrepp, fysisk skada eller mekanisk störning utlösa förtida frigivning av inhemska hemocyter i omlopp. Switchen av larv hemocyter mellan inhemska platser och spridning ökar behovet av en gemensam standard / procedur för att selektivt isolera och kvantifiera dessa två populationer av blodceller från enda Drosophila larver. Följaktligen beskriver detta protokoll en automatiserad metod för att frigöra och kvantifiera vårdtagaren och cirkulerande hemocyter från enstaka larver. Metoden underlättar ex vivo metoder, och kan anpassas för att tjäna en mängd olika utvecklingsstadier av Drosophila och andra ryggradslösa organismer.
Forskning inom ryggradslösa modellen Drosophila melanogaster har drivit upptäckten av medfödd immunitet 1, och har underlättat förståelsen för olika aspekter av blodcellutveckling 2-4. Drosophila hematopoies kan delas in i härstamningen av embryonala / larver hemocyter, som har sitt ursprung i embryo och expandera i larven och linjen av lymfkörtel hemocyter 4,5. Här presenterar vi ett protokoll som fokuserar på härstamningen av embryonala / larver hemocyter, som i Drosophila larven huvudsakligen består plasmatocytes (makrofager) och några kristallcellerna 4. I larven, hemocyter av embryot kvarstår och koloniserar segment upprepade och terminal Hematopoietic Fickor (HPs) ligger mellan epidermis och muskel skikt av larvkroppen väggen 5,6. Baserat på deras natur som självförnyande makrofager 6, sin dominerande bosättning i lokala vävnadsmikromiljöer 6, 7, och deras härstamning från de tidigaste blodkropparna framväxande under utveckling 6,8, är detta blod cellpopulation anses likna ryggradsdjur självförnyande vävnadsmakrofager, en oberoende myeloid härstamning nyligen identifierats i en mängd olika arter 4,9,10. Men i Drosophila, några eller alla av dessa residensceller visar också plasticitet för att ge upphov till andra blodkroppstyper såsom kristallceller 11,12.
Larver hemocyter är främst bosatta (sessile), men befinner sig i en dynamisk steady-state mellan olika HPs. De successivt släppas ut på marknaden, i synnerhet som den 3: e INSTAR larv närmar pupariation 5-7. Immun utmaningar, skada eller mekanisk störning leder till en för tidig, i det senare fallet reversibla, mobilisering av inhemska hemocyter i hemolymfan 4,6,13.
Tidigare studier har antytt att inhemska och cirkulerarlarver hemocyter är av samma härstamning, men skiljer sig i sina lim eller målsökande egenskaper 6,7,13,14. Selektiv isolering av cirkulerande kontra inhemska hemocyter visade förhöjda halter av proliferation i den bofasta hemocyte befolkningen, vilket tyder på deras exponering för induktiva signaler från HPs 6. Drosophila larv HPs är kantade av epidermis och muskelskikt och ytterligare hyser sensoriska neuron kluster av det perifera nervsystemet (PNS) och leverfunktion som liknar oenocytes 6. Funktionellt har muterade och genetiska cell ablation experiment visade att sensoriska neuroner som finns i HPs stöder trofiska överlevnad och lokalisering av larv hemocyter 6.
Här beskriver vi en metod för den specifika isolering och kvantifiering av inhemska och cirkulerande hemocyter från enda Drosophila larver, och ett protokoll för mekanisk hemocyte mobilisering. Metoderna kan användas för ex vivostudie av hemocyter och kan vidare anpassas till andra Drosophila utvecklingsstadier såsom puppan och vuxna, och andra ryggradslösa system. Eftersom tidigare studier inte skilja mellan inhemska och cirkulerande hemocyter, ger detta protokoll en gemensam standard för studier av inhemska blodceller och kommer att bidra till att öka samstämmigheten ryggradslösa blodcellsforskning.
För det första hemocyte Bleed / Skrapa analys beskriver differential isolering och automatiserad kvantifiering av fluorescerande protein-märkta bosatt och cirkulerande hemocyte populationer från enda Drosophila larver; protokollet finns två alternativ för regelbundna och kakel skanna utrustade mikroskop (Figur 1). Som ett resultat, är den procentuella andelen av cirkulerande hemocyter och det totala antalet av hemocyter per larv erhölls. Metoden bygger på transgen Drosophila larver som uttrycker fluorescerande protein bland deras blodkropparbefolkning. Valet av hemocyte föraren eller reporter avgör resultatet, det vill säga vilken population av blodceller visualiseras och kvantifieras. Att märka huvudsakligen makrofager (plasmatocytes), som utgör den stora majoriteten av inhemska och cirkulerande hemocyte befolkningen i Drosophila larven 6, lämpliga transgener innefattar Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 (genom H. Agaisse 16), eller eater-GAL4 17; för märkning av relativt liten population av kristallceller, lämpliga linjer är BcF6-gemensamma fiskeripolitiken och -GFP 18 eller LZ-GAL4 (J. Pollock 19), för att märka lamellocytes, en specialiserad celltyp främst framkallad av immun utmaningar och skada 13, t.ex. har MSNF9mo-mCherry användas 17. Vissa transgena förare uttrycks i en rad differentierad blodceller och stamceller, såsom han – GAL4 20, vilka etiketter cirka 80% av alla larver blodkroppar 20. Observera att i samtliga fall där GAL4 förare används kombination med UAS-GFP eller annan fluorescerande protein UAS-transgen krävs. I resultatdelen är denna metod används för att övervaka blodcellantalet och cirkulation beteende under loppet av larvutveckling.
För det andra, den hemocyte Störning analys beskriver ett föregående steg utformad att lösgöra inhemska hemocyter genom extern manipulering, som därefter medger utvärdering av förmågan hos hemocyter att åter ansluta sig och hem till HPS inom en begränsad tidsperiod (30 – 60 min) 6. Typiskt denna analys följs av luftnings / Skrapa analys för att bestämma den procentuella andelen av cirkulerande hemocyter per larv. Vi presenterar ett förenklat protokoll för denna analys (figur 1D), som använder störning genom att vortexa with glaspärlor, snarare än manipulering av enstaka larv med en pensel som beskrivits tidigare 6. I avsnittet Resultat, är denna analys som används för att visa att övergående fristående hemocyter flyta i hemolymfa och kan återvinnas i fraktionen av cirkulerande hemocyter. Analysen är också användbar för att kvantifiera skillnaderna i hemocyter i deras målsökande / vidhäftning till inhemska platser, jämför till exempel, olika genetiska bakgrunder eller stimuleringsförhållanden. Observera att denna mekaniska manipulation avspeglar en reversibel process och skiljer sig från Infektions- eller skada inducerad bosatt hemocyte mobilisering, som normalt inte är reversibla på kort tid 4,13.
Här beskriver vi den första metoden för att kvantitativt utvinna bosatta och cirkulerande blodceller från enkelt Drosophila larver, och kvantifiera dessa två hemocyte populationer. Protokollet innefattar den sekventiella frisättningen av cirkulerande och inhemska blodceller, följt av avbildning och automatiserad cellräkning. Larv inhemska hemocyter kan tillfälligt mobiliseras i omlopp genom mekanisk störning, en process som är känd för att vara i stort sett återförda inom en 30-60 min återhämtningsperiod 6. Följaktligen har detta protokoll testades på två sätt, (1) genom att bedöma det totala hemocyte antalet per larv och fraktion av cirkulerande hemocyter under loppet av larvutveckling, och (2) genom experimentellt lossnar bosatta hemocyter med hjälp av en automatiserad metod, som bekräftade tight korrelation mellan hemocyte lokalisering och hemocyte nummer i inhemska och cirkulerande befolkningar. Dessutom var den metodens reproducerbarhet demonstreras genom sammparing två datauppsättningar av biologiska replikat.
I det förflutna, har laboratorier använt en rad tekniker för att kvantifiera larv hemocyter 6,13,21. Detta protokoll upprättas en gemensam standard för att hämta och kvantifiera bosatta och cirkulerande blodcellpopulationer från Drosophila larver, vilket ger en lätt anpassningsbar plattform. Den beskrivna metoden är avgörande för studier som fokuserar på den roll som inhemska hemocyter och deras mikromiljö, fickor Hematopoietic 4-6, och är lämplig för att studera fluorescerande protein transgen bärande Drosophila stammar i vildtyp och genetiskt modifierade bakgrunder. Protokollet är också relevant för studier som fokuserar på hemocyte mobilisering efter immun utmaning eller skada, och genetiskt eller miljömässigt inducerad signalering som utlöser mobilisering av inhemska hemocyter eller förändringar i totalt hemocyte nummer (översikt i 4). Det bör noteras att, i fall av förtida differentiation och frisättning av hemocyter från lymfkörtel, skilja embryonal / larver kontra lymfkörtel linjerna kan begränsas av uttrycksmönstret av det fluorescerande hemocyte reporter används.
Protokollet presenteras här bygger på avbildning levande, fluorescensmärkta hemocyter. I framtiden kan det modifieras för att möjliggöra detektion av frigjorda celler efter fixering, t.ex. med hjälp av immuncytokemi. I detta fall kan protokollet behöva anpassas för att säkerställa fullständig vidhäftning av blodceller, till exempel genom att öka vidhäftning inkubationstider och lägga lim glidbeläggning, såsom concanavalin A. Eftersom metoden tillåter hämtning av hemocyter och deras manipulation ex vivo, kommer det att gynna många av utvecklings-, cellbiologiska och biokemiska studier. Resident och cirkulerande blodkroppar finns under alla postembryonic utvecklingsstadier av Drosophila och andra ryggradslösa 22, suggesting att en anpassning av denna metod kommer att gynna ett brett spektrum av studier utanför Drosophila larv hematopoietiska systemet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jesper Kronhamn och Dan Hultmark, Michael Galko och Bloomington Stock Centrum för flyga bestånd. Ett särskilt tack till Courtney Onodera för rådgivning med statistisk analys. Vi tackar Katrina Guld för kritisk läsning av manuskriptet, och Kalpana Makhijani, Katrina guld, medlemmar av Derynck laboratorium och medlemmar av Nystul laboratoriet för diskussion och kommentarer på manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från UCSF Program för Genombrott biomedicinsk forskning (PBBR), Broad Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1326268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 och 1R56HL118726-01A1 (till KB).
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |