細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup> 2+</sup>取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
カルシウムは、血管組織の多くの生理学的プロセスの非常に重要な調節因子です。ほとんどの内皮および平滑筋の機能は非常に細胞内カルシウム（[Ca 2+] i） の一酸化窒素（NO）の変化に依存します。の[Ca 2+] i の 、NOおよび下流分子は血管収縮薬および血管拡張薬に反応して血管によってどのように処理されるかを理解するために、我々はカルシウム標識（またはNO標識）を適用する新規な技術を開発した2光子顕微鏡を有する色素単離された血管におけるカルシウム処理（またはNO産生）を測定しました。ここで説明した内皮細胞または平滑筋細胞内にラット、ラベルカルシウムまたはNOから大動脈を分離する方法を示す詳細なステップバイステップの手順であり、画像のカルシウムトランジェント（またはNO産生）生理次の2光子顕微鏡を用いて、または薬理学的刺激。この方法を使用する利点は、複数倍である：1）それは、同時にすることが可能ですLY異なる刺激に応答して、両方の内皮細胞および平滑筋細胞におけるカルシウムトランジェントを測定します。 2）それは、画像の内皮細胞とそれらの天然の環境における平滑筋細胞のいずれかを可能にします。 3）この方法は、細胞内カルシウムまたはNO変化に非常に敏感であり、正確な測定のための高解像度の画像を生成します。 4）記載の手法は、活性酸素種のような他の分子の測定に適用することができます。要するに、2光子レーザ発光顕微鏡の応用カルシウムトランジェントを監視し、単離された血管の内皮細胞および平滑筋細胞におけるNO産生は、高品質の定量的データを提供しておらず、血管機能を調節するメカニズムの理解を推進してきました。
Introduction
カルシウムは、内皮細胞および平滑筋細胞などの血管細胞内の基本的なセカンドメッセンジャーです。これは、血管収縮のための主要な刺激であり、内皮内のNO発生を介してその効果を含め、血管拡張において重要な役割を果たしています。これにより、撮像技術の制限のために、それは、無傷の血管内カルシウム処理を観察することは事実上不可能でした。 2光子イメージングシステムと新しいカルシウムの作成またはNO標識色素の開発は、カルシウム動態及び血管系内のNO産生を理解し始めるために十分な深さと解像度でイメージすることができます。
二光子顕微鏡は、最近ので、深く低いバックグラウンド蛍光と高い信号感度で組織に浸透するその優れた能力の組織、器官、さらには全体の動物試験に適用されている。1,2イルミネータで2光子励起の狭いスペクトルイオン焦点と非デスキャン検出器の使用は、2光子顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡よりも優れている理由です。共焦点顕微鏡は、自動蛍光および共焦点ピンホールへのピンボケ光の散乱に起因する必要な組織深さで高品質の画像を生成することはできません。したがって、我々は、[Ca 2+] i のシグナルを測定するために2つの光子顕微鏡を使用する方法と、高解像度、低信号対雑音比を有する無傷の、個々の血管細胞におけるNO産生を開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験の概要。より良い血管生理学にカルシウムの寄与を理解し、NOに、新規な方法を測定するために開発されたの[Ca 2+] iと内の平滑筋および単離された無傷の大動脈の内皮細胞NO。 1）機械的分離と準備（酵素消化ない）容器の：一緒に、このプロトコルは、これらの重要なステップで構成されています。これは最適な生理学的記録を得ることが可能な限り健康で無傷?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、イメージング研究のヘルプは博士ウィリアムCashdollar、およびウィスコンシン州の血液研究所のノースウェスタン·ミューチュアル財団イメージングセンターに感謝します。また、この原稿で、有用な議論の重要な読書のための博士ダリアIlatovskayaに感謝します。本研究は、（AS）に健康補助金HL108880と（AMG）はDP2-OD008396の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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