In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

Summary

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Abstract

Recentes avanços na aplicação de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSC) para o tratamento de lesões de tendões e ligamentos no cavalo sugerem melhorou medidas de resultados em ambos os estudos experimentais e clínicos. Embora o BMMSC está implantado no interior da lesão do tendão em grandes números (geralmente 10 – 20 milhões de células), apenas um número relativamente pequeno sobrevivência (<10%), embora estes podem persistir por até 5 meses após a implantação. Esta parece ser uma observação comum em outras espécies onde BMMSC foram implantados em outros tecidos e é importante para entender quando ocorre esta perda, quantas sobreviver ao processo de implantação inicial e se as células são apagadas em outros órgãos. Acompanhando o destino das células pode ser conseguida por radiomarcação do BMMSC antes da implantação que permite não invasiva in vivo de imagens de localização da célula e a quantificação do número de células.

Este protocolo descreve uma célula labeling procedimento que usa Tecnécio-99m (Tc-99m), e acompanhamento destas células após a implantação em tendões flexores de feridos em cavalos. Tc-99m é uma (t _1/2 de 6,01 h) do isótopo de vida curta que emite raios gama e podem ser internalizados pelas células na presença do composto lipofílico hexametilpropilenoamina oxima (HMPAO). Essas propriedades tornam ideal para uso em clínicas de medicina nuclear para o diagnóstico de muitas doenças diferentes. O destino das células marcadas podem ser seguidas no curto prazo (até 36 horas) por cintigrafia gama para quantificar tanto o número de células retidos na lesão e distribuição das células nos pulmões, tireóide e outros órgãos. Esta técnica é uma adaptação da rotulagem dos leucócitos do sangue e pode ser utilizado para imagem BMMSC implantado em outros órgãos.

Introduction

Estratégias regenerativos para a reparação dos tecidos doentes ou danificados são baseados em células estaminais multipotentes derivadas de uma variedade de tecidos e implantados na área afectada. Os recentes avanços na aplicação das autólogo BMMSC para o tratamento do tendão e lesões ligamentares no cavalo têm mostrado melhorar as medidas de resultado, tanto experimental ^1-5 e estudos clínicos ^6. O cavalo é um modelo particularmente atraente para avaliar a eficácia de células-tronco tratamentos relacionados porque ele sofre de idade e overstrain lesões relacionadas com os tendões do membro anterior distal, é um animal atlético, e é uma facilitando a recuperação grande, medula óssea e implantação precisa. Lesões do tendão de curar naturalmente com fibrose mas o tendão curado é funcionalmente inferior ⁷ e tem um alto risco de nova lesão ^8. O tendão flexor digital superficial (TFDS) é mais comumente afetados como tem evoluído a agir como uma energia elásticaloja e experiências de alta carga salienta a alcançar eficiência energética e locomoção de alta velocidade. Restaurar a função após a lesão é, portanto, fundamental. Estas lesões são semelhantes às que ocorrem no tendão de Aquiles em seres humanos, que desempenha uma função semelhante ^9. Não existem opções boas de tratamento para tratar ou alcançar bom estado de conservação para essas lesões, as estratégias regenerativas, portanto, com base nas células oferecem uma oportunidade atraente para melhorar os resultados e reduzir a re-ferimento.

Na maioria dos estudos de 5 – 20 milhões de BMMSC autólogo são injectados directamente na lesão, que normalmente ocorrem no interior do núcleo do corpo que, por conseguinte, tendão actua como um receptáculo para as células. O destino das células injetadas uma vez não é métodos claros e diferentes de rotulagem celular para rastrear as células foram descritos recentemente. As células marcadas com um marcador de fluorescência foram mostrados para sobreviver apenas em quantidades relativamente pequenas (<10%) ^10,11. Etiquetas de fluorescência exigirextracção de tecidos e para análise histológica de corte, que é moroso e não prontamente facilitar a análise temporal em um modelo animal grande ou nos casos clínicos. Em trabalhos mais recentes que temos usado o radioisótopo ^99m Tc para rotular células e seguir seu destino por cintigrafia gama ^1. Este método permite comparações rápidas para ser feita entre diferentes vias de administração de células, incluindo por via intravenosa, intralesional através da veia jugular ¹ ou perfusão regional via intra-arterial ou intravenosa, ^{12 1,12} injecções. A persistência e distribuição de células podem então ser trabalhada por cintigrafia gama de vários órgãos. Isto demonstrou que apenas 24% das células injectadas intralesionalmente permaneceu na lesão por ¹ h 24 e este é suportado por um outro estudo usando lesões criados experimentalmente e usando o mesmo marcador radioactivo ^5. Além disso, as células apresentam capacidade limitada para casa em lesões tendíneas quando delivered por perfusão regional ou por via intravenosa, mas são dispersos nos pulmões pelas últimas vias ^4.

BMMSC marcadas com nanopartículas de ferro é um método alternativo para controlar células implantadas em tendões ¹³ membros anteriores. Embora as células marcadas de nanopartículas de ferro permitir o rastreamento de células in vivo por ressonância magnética, os estudos temporais em um animal de grande porte são limitados pelo número de vezes que a anestesia pode ser administrada em cada ponto de tempo para realizar as imagens de ressonância magnética. Além disso, as nanopartículas de ferro são hipointensa em MRI que limita a informação sobre a migração de células marcadas no corpo do tendão. Outros isótopos radioactivos que podem ser utilizados incluem Índio-111, mas esta tem a desvantagem de uma meia-vida mais longa do que o Tc-99m (2,8 dias vs 6,0 h) e uma energia mais elevada de emissão de raios gama. Além disso, a viabilidade celular foi relatado para ser reduzida quando marcados com índio-111 ^14. Tc-99m, por outro lado, é rotineiramente utilizada em ambos nuclear equina e humanamedicina para rotular células mononucleares do sangue periférico e siga sua distribuição in vivo pela cintilografia. Ele pode ser relativamente facilmente absorvidos pelas células utilizando HMPAO como uma molécula de ligação para ligar o tecnécio, como Tc-99m-HMPAO, às células. Tc-99m-HMPAO marcado BMMSC mostrar boa viabilidade e podem proliferar in vitro ^4. Este protocolo detalha a rotulagem e rastreamento de BMMSC autólogo eqüino implantados em lesões que ocorrem naturalmente no TFDS membro anterior.

É importante notar que o protocolo destina-se apenas a ser utilizado como uma ferramenta de pesquisa. A sua utilização como uma modalidade terapêutica clínica não é recomendada como o efeito do marcador radioactivo no fenótipo celular não foi totalmente elucidado.

Protocol

Os casos aqui descritos foram realizados seguinte permissão de Ética concedidas pelo Comité de animal Ética e Bem-Estar da Colegio de Veterinarios de Málaga, em Espanha, e do Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Os procedimentos utilizados nos cavalos são baseados em protocolos aprovados que são utilizado na clínica em cavalos que recebem terapias baseadas células-tronco que inclui sedação, aspiração de medula óssea, a injeção intra-tendinosa, perfusão regional, injecção intravenosa, pó…

Representative Results

Tc-99m-HMPAO incorporação BMMSs não afeta negativamente a sua capacidade de aderir à cultura de tecidos de plástico e enquanto eles mostram capacidade de proliferação para formar monocamadas (Figura 1) que não tem completamente determinado se as taxas de proliferação ou outros fenótipos celulares são afetados. A sua morfologia é semelhante às células não marcadas com uma forma típica de fuso. A eficiência de marcação celular (isto é., A captação do marcador) tipicamente v…

Discussion

Além de medula óssea, as células estaminais isoladas a partir de fontes tais como o tecido adiposo são adequados para marcação com este protocolo. Além disso, as células de um estado congelado pode ser revivido e expandidas em cultura para os números desejados para estudos de rotulagem ^12.

Um factor crítico que determina a eficiência de marcação do BMMSC é o tempo entre a eluição do Tc-99m a partir do gerador de molibdénio no radiopharmacy, Preparação de Tc-99m-…

Materials

Technetium99m			Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.  The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator
Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)	GE HealthCare		Please enquire directly with GE HealthCare
Microfuge, Minispin/Minispin Plus	Ependorf	22620100
18G and 19G Needles	Terumo Medical	NN-1838R (18G);         NN1938R (19G)
Syringes 1 mL and 2 mL	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS – Phosphate-Buffered Saline	LifeTechnologies	14190
Sterile Gauze Swabs	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet self adhering bandage	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
Ultrasound imaging software	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus Scintigram processing software	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
Field isotope counter for monitoring isotope	John Caunt U.K.	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
Well counter for isotope measurements, dose calibrator	Capintec Southern Scientific	CRC-25R