In vivo-billeddannelse og sporing af technetium-99m-mærkede Bone Marrow mesenchymale stamceller i Equine tendinopati

Summary

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Abstract

Nylige fremskridt i anvendelsen af ​​knoglemarven mesenkymale stamceller (BMMSC) til behandling af sener og ledbåndsskader i hesten foreslår forbedret resultatmål i både eksperimentelle og kliniske studier. Selvom BMMSC implanteres i senen læsion i stort antal (sædvanligvis 10 – 20 millioner celler), kun et relativt lille antal overleve (<10%), selv om disse kan vare i op til 5 måneder efter implantation. Dette synes at være en almindelig observation i andre arter, hvor BMMSC er blevet implanteret i andre væv, og det er vigtigt at forstå, når dette tab sker, hvor mange overlever den indledende implantation proces og om cellerne blokerede i andre organer. Sporing skæbne af cellerne kan opnås ved radioaktiv mærkning af BMMSC før implantation, som tillader ikke-invasiv in vivo billeddannelse af celler placering og kvantificering af celleantal.

Denne protokol beskriver en celle labeling procedure, der bruger technetium-99m (Tc-99m), og sporing af disse celler efter implantation i såret bøjesenerne i heste. Tc-99m er en kortvarig (t _{1/2 af} 6,01 timer) isotop, der udsender gammastråler og kan internaliseres af celler i nærværelse af den lipofile forbindelse hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO). Disse egenskaber gør den ideel til brug i nuklearmedicinske klinikker til diagnosticering af mange forskellige sygdomme. Skæbnen for de mærkede celler kan følges på kort sigt (op til 36 timer) ved gamma-scintigrafi at kvantificere både antallet af celler tilbageholdt i læsionen og distribution af cellerne i lungerne, skjoldbruskkirtlen og andre organer. Denne teknik er tilpasset fra mærkning af blodleukocytter og kunne anvendes til at afbilde implanteret BMMSC i andre organer.

Introduction

Regenerative strategier til reparation af syge eller beskadigede væv er baseret på multipotente stamceller fra en række af væv og implanteret i det berørte område. Nylige fremskridt i anvendelsen af autologe BMMSC til behandling af senen og ledbåndsskader i hesten har vist forbedrede resultatmål i både eksperimentel ^1-5 og kliniske studier ^6. Hesten er en særlig attraktiv model til vurdering af effektiviteten af ​​stamcellerelateret behandlinger, fordi det lider alder og overanstrenger relaterede skader til sener af den distale forben, det er en atletisk dyr, og det er en stor, lette knoglemarvstransplantation nyttiggørelse og nøjagtig implantation. Seneskader helbrede naturligt med fibrose men helet senen er funktionelt ringere ⁷ og har en høj risiko for re-skade ^8. Den overfladiske digitale flexor senen (SDFT) er mest almindeligt berørt, da det har udviklet sig til at fungere som en elastisk energiStore og erfaringer høj belastning understreger at opnå energieffektiv og høj hastighed bevægelse. Gendannelse funktion efter skade er derfor kritisk. Disse skader er magen til dem, der påvirker akillessenen i mennesker, der udfører samme funktion ^9. Der er ingen gode behandlingsmuligheder til at behandle eller opnå god reparation for sådanne skader, derfor cellebaserede regenerative strategier tilbyde en attraktiv mulighed for at forbedre resultaterne og reducere re-skade.

I de fleste undersøgelser 5 – 20 mio autolog BMMSC injiceres direkte ind i læsionen, som normalt forekommer i kernen af ​​senen organ som derfor fungerer som en beholder for cellerne. Den skæbne af cellerne, når injicerede er ikke klare og forskellige celle mærkning metoder til at spore cellerne er blevet beskrevet for nylig. Celler mærket med et fluorescens-tag blev vist til kun overleve i relativt små mængder (<10%) ^10,11. Fluorescensmærker nødvendiggørvæv udvinding og skæring til histologisk analyse, som er tidskrævende og ikke let lette tidsmæssig analyse i en stor dyremodel eller i kliniske tilfælde. I nyere arbejde har vi brugt radioisotopen ^99mTc at mærke celler og følge deres skæbne ved gammascintigrafi ^1. Denne metode giver hurtige sammenligninger mellem forskellige ruter af celle levering, herunder intralæsional, intravenøs via halsvenen ^{1 eller} regional perfusion via intra-arterielle ¹² eller intravenøse ^1,12 injektioner. Persistensen og distribution af celler kan derefter afbildes ved gamma-scintigrafi af forskellige organer. Dette har vist, at kun 24% af de injicerede celler intralæsionalt forblev i læsionen med 24 timer ^{1, og dette} understøttes af en anden undersøgelse ved anvendelse af eksperimentelt skabt læsioner og med samme radiomærke ^5. Desuden viser cellerne begrænset evne til at hjem til sener læsioner, når delivered ved regional perfusion eller intravenøst, men er spredt i lungerne af sidstnævnte ruter ^4.

BMMSC mærket med jern nanopartikler er en alternativ metode til at spore celler implanteret i forben sener ^13. Selv om jern nanopartikel mærkede celler tillader cellesporing in vivo ved hjælp af MRI, er tidsstudier i et stort dyr begrænset af det antal gange anæstesi kan indgives på hvert tidspunkt for udførelse af MR-scanninger. Endvidere jern nanopartikler er hypointense på MRI som begrænser oplysninger om migration af mærkede celler i senen kroppen. Andre radioisotoper, der kan anvendes, indbefatter Indium-111, men dette har den ulempe af en længere halveringstid end Tc-99m (2,8 dage versus 6,0 timer) og højere emission energi gamma ray. Desuden er der rapporteret cellelevedygtighed at blive reduceret, når mærket med indium-111 ^14. Tc-99m, på den anden side er rutinemæssigt anvendes i både heste og menneskelig nuklearemedicin til at mærke perifere mononukleære blodceller og følge deres fordeling in vivo ved scintigrafi. Det kan relativt let optages af celler under anvendelse af HMPAO som et linkermolekyle til at binde technetium, som Tc-99m-HMPAO, til celler. Tc-99m-HMPAO mærkede BMMSC viser god levedygtighed og kan formere in vitro ^4. Denne protokol beskriver mærkning og sporing af heste autolog BMMSC implanteret i naturligt forekommende læsioner i forben SDFT.

Det er vigtigt at bemærke, at protokollen kun er beregnet til at blive anvendt som et forskningsværktøj. Dets anvendelse som en klinisk terapeutisk modalitet anbefales ikke, da virkningen af ​​det radioaktive på cellefænotype er ikke fuldt klarlagt.

Protocol

De heri beskrevne tilfælde blev udført efter Etisk tilladelse fra Det Dyreetiske og Trivsel i Colegio de Veterinarios de Malaga, Spanien, og Royal Veterinary College, North Mymms, UK procedurer, der anvendes på heste, er baseret på godkendte protokoller, der er anvendes i klinikken på heste, der modtager stamceller baserede terapier som omfatter sedation, knoglemarv aspiration, intra-tendinous injektion, regional perfusion, intravenøs injektion, post-processuelle behandling og smertebehandling og overvågning efte…

Representative Results

Tc-99m-HMPAO inkorporering i BMMSs ikke påvirker deres evne til at klæbe til vævskultur plast og mens de viser spredning evne til at danne monolag (figur 1) ikke har vi fuldt ud besluttet på, om spredning satser eller andre cellulære fænotyper er berørt. Deres morfologi ligner umærkede celler med en typisk spindel form. Den cellulære mærkning effektivitet (dvs.., Optagelse af etiketten) varierer typisk fra ca. 1,5% til 25%. Den væsentligste årsag til den lave mærkning effektivitet …

Discussion

Ud over knoglemarv, stamceller isoleret fra kilder såsom fedtvæv er egnede til mærkning med denne protokol. Desuden kan celler fra en frossen tilstand blive genoplivet og udvidet i kultur til de ønskede tal til mærkning undersøgelser ^12.

En kritisk faktor, som bestemmer effektiviteten af ​​mærkning af BMMSC er tiden mellem eluering af Tc-99m fra molybdæn generator på radiofarmaci, fremstilling af Tc-99m-HMPAO og anvendelse af det radiofarmaceutiske i klinikken. Der er…

Materials

Technetium99m			Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.  The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator
Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)	GE HealthCare		Please enquire directly with GE HealthCare
Microfuge, Minispin/Minispin Plus	Ependorf	22620100
18G and 19G Needles	Terumo Medical	NN-1838R (18G);         NN1938R (19G)
Syringes 1 mL and 2 mL	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS – Phosphate-Buffered Saline	LifeTechnologies	14190
Sterile Gauze Swabs	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet self adhering bandage	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
Ultrasound imaging software	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus Scintigram processing software	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
Field isotope counter for monitoring isotope	John Caunt U.K.	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
Well counter for isotope measurements, dose calibrator	Capintec Southern Scientific	CRC-25R