말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 이미징 및 추적에서
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
말의 힘줄 및 인대 손상의 치료를위한 골수 중간 엽 줄기 세포 (BMMSC)의 응용 프로그램에서 최근 진보는 실험과 임상 연구 모두에서 결과 측정을 개선하는 것이 좋습니다. BMMSC는 많은 수의 건 병변에 주입되어 있지만 (일반적으로 10-20000000 세포) 만 상대적으로 적은 수의 생존 (<10 %)이가 이식 후 최대 5 개월 동안 지속될 수 있지만. 이 BMMSC 다른 조직으로 이식 된 다른 종의 일반적인 관측이 나타납니다이 손실이 많은 초기 주입 공정에서 살아남을 방법과 세포가 다른 장기로 삭제 여부, 발생했을 때 그것을 이해하는 것이 중요합니다. 세포의 운명을 추적하는 셀 위치 및 세포 수를 정량화의 생체 촬상의 비 침습적으로 허용 주입 BMMSC 전에 방사성 표지에 의해 달성 될 수있다.
이 프로토콜은 셀을 설명 labeli말의 부상 굴근 힘줄에 테크네튬 (TC-99m), 및 주입 다음이 세포의 추적을 사용 NG 절차. TC-99m 감마선을 방출 및 친 유성 화합물 hexamethylpropyleneamine 옥심 (HMPAO)의 존재 하에서 세포에 의해 내재화 될 수 단명 (t 1/2 6.01의 HR) 동위 원소이다. 이러한 속성은 여러 가지 질병의 진단을위한 핵 의학 클리닉에서 사용하기에 이상적이다. 표지 된 세포의 운명은 폐, 갑상선 및 다른 장기에 병변 세포의 분포에 보유 세포의 수를 모두 정량화 감마 신티 의한 단기 (36 시간까지)에 따라 될 수있다. 이 기술은 혈액 백혈구 라벨링 각색 및 다른 장기에 이식 BMMSC 이미지에 이용 될 수있다.
Introduction
병에 걸린 또는 손상된 조직의 복구를위한 재생 전략은 영향을받는 영역으로의 다양한 조직으로부터 유도 된 다 능성 및 주입 된 줄기 세포를 기반으로한다. 말의 힘줄 및 인대 손상의 치료를위한자가 BMMSC의 응용 프로그램에서 최근 진보는 모두 실험 1-5에서 개선 된 결과 측정 및 임상 연구 (6)을 보여 주었다. 말은 나이 앓고 및 원위 앞다리의 힘줄에 관련 부상 과도한 긴장, 그것은 운동 동물 때문에 치료 관련 줄기 세포의 효능을 평가하는데 특히 매력적인 모델이며,이 큰 용이 골수 회복이며 정확한 주입. 힘줄 손상은 섬유화와 함께 자연스럽게 치유하지만 치유 건 7 기능적으로 열등하고 다시 부상 (8)의 위험이 있습니다. 이 탄성 에너지의 역할을하도록 진화로 표면 디지털 굴근 건 (SDFT)는 가장 일반적으로 영향을받는상점과 경험을 높은 부하는 에너지 효율과 고속 운동을 달성하기 위해 강조하고있다. 손상 후 기능을 복원 때문에 중요하다. 이 부상은 유사한 기능 (9)을 수행 인간의 아킬레스 건에 영향을 미치는 것과 유사하다. 따라서 세포 기반 재생 전략이 성과를 향상시키고 재 부상을 줄이기 위해 매력적인 기회를 제공, 치료 또는 부상에 대한 좋은 보수를 달성하기 위해 더 좋은 치료 옵션이 없습니다.
대부분의 연구에서 5-20000000자가 BMMSC 보통 따라서 세포 수용기로서 작용 건 본체의 코어 내에서 발생하는 병변에 직접 주입된다. 일단 주입 된 세포의 운명은 세포가 최근 기술되었다 추적 명확하고 다른 세포 표지 방법이 아니다. 형광 태그로 표시된 셀은 상대적으로 적은 수의 (<10 %) 10, 11에서 생존 것으로 나타났다. 형광 라벨이 필요로시간을 소비하고하지 않는 조직 학적 분석을위한 조직 추출 및 단면은 쉽게 큰 동물 모델에서 임상의 경우 시간적 분석을 용이하게한다. 최근 연구에서 우리는 세포 레이블 및 감마 신티그라피 (1)에 의해 자신의 운명을 따라 방사성 동위 원소 99m Tc를 사용했다. 이 방법은 빠른 비교는 12 동맥 또는 정맥 주사를 통한 1,12- 경정맥 1 지역을 통해 정맥 내 관류 병변을 포함한 세포의 다른 전달 경로 사이에서 이루어질 수있다. 세포의 지속성과 분포는 다음 여러 장기의 감마 신티그라피에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이것은 세포의 24 %가 24 시간 intralesionally (1)에 의해 병변에 남아 주입이 실험적으로 생성하여 병변과 같은 방사성 표지 (5)를 사용하여 다른 연구에 의해지지되는 것을 보여 주었다. 또한, 세포는 delivere 힘줄 병변으로 가정 제한 능력을 보여정맥 지역 관류 또는 의해 거라고하지만 후자의 노선 (4)에 의해 폐에 분산되어있다.
철 나노 입자로 표지 BMMSC는 앞다리 힘줄 (13)에 이식 된 세포를 추적 할 수있는 또 다른 방법이다. 철 나노 입자 표지 된 세포는 MRI에 의해 생체 내에서 세포의 추적을 허용하지만, 많은 동물 연구는 시간적 마취 MRI 스캔을 수행하기위한 각각의 시점에서 투여 할 수있는 횟수가 제한된다. 또한, 철 나노 입자는 건 본체로 표지화 된 세포의 이동에 대한 정보를 제한 MRI에 hypointense이다. 사용될 수있는 다른 방사성 동위 원소는 인듐-111을 포함하지만 이것 테크네튬 99m보다 더 긴 반감기의 불이익 (VS 2.8 일 6.0 시간) 및 높은 감마선 방사 에너지를 겪고있다. 인듐 – 111 (14)으로 표시 할 때뿐만 아니라, 세포 생존율이 감소 될 것으로보고되었다. TC-99m, 다른 한편으로는, 일상적으로 말 두 인간 핵에 사용약은 말초 혈액 단핵 세포를 라벨 및 신티그라피에 의해 생체 내에서의 분포를 따르십시오. 이것은 비교적 용이 세포, 테크네튬 99m-HMPAO 같은 테크네튬 바인딩 링커 분자로서 HMPAO을 이용하여 상기 셀에 의해 흡수 될 수있다. TC-99m-HMPAO는 BMMSC 좋은 가능성을 보여주고 체외 4에서 증식 할 수 표시. 이 프로토콜은 앞다리의 SDFT에서 자연적으로 발생하는 병변에 주입 라벨과 말자가 BMMSC의 추적을 자세히 설명합니다.
이것은 프로토콜 만 의도 연구 도구로서 이용 될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 임상 치료 양상으로 그것의 사용은 완전히 해명되지 않은 세포 표현형에 방사성 표지의 효과하지 않는 것이 좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골수 외에도, 이러한 지방 조직과 같은 소스로부터 격리 줄기 세포는이 프로토콜에 표시하기에 적합하다. 또한, 냉동 상태에서 세포 부활 및 라벨 연구 (12)에 대해 원하는 번호로 문화 확장 할 수있다.
BMMSC 레이블의 효율성을 결정하는 중요한 요소는 radiopharmacy에서 몰리브덴 발생기는 TC-99m의 용출 사이의 시간, Tc를-99m-HMPAO의 준비 및 병원에서 방사성 의약품의 사용?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
Riferimenti
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, 23-26 (1997).
- O’Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
