In vivo Imaging och spårning av teknetium-99m märkt benmärg mesenkymala stamceller i Equine tendinopati

Summary

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Abstract

Nyligen gjorda framsteg inom tillämpningen av benmärgs mesenkymala stamceller (BMMSC) för behandling av sen- och ligamentskador i hästen föreslår förbättrad effektmått i både experimentella och kliniska studier. Även om BMMSC implanteras i senan skada i ett stort antal (normalt 10 – 20 miljoner celler), bara ett relativt litet antal överleva (<10%), även om dessa kan kvarstå i upp till 5 månader efter implantation. Detta verkar vara en vanlig observation i andra arter där BMMSC har implanterats in i andra vävnader, och det är viktigt att förstå när denna förlust inträffar, hur många överlever den inledande implantationsprocessen och om cellerna rensas in i andra organ. Spårning ödet av cellerna kan åstadkommas genom radiomärkning av BMMSC före implantering vilket tillåter icke-invasiv in vivo-avbildning av cellposition och kvantifiering av cellantal.

Detta protokoll beskriver en cell labeling procedur som använder Teknetium-99m (Tc-99m), och spårning av dessa celler efter implantation i skadade flexorsenor hos hästar. Tc-99m är en kortvarig (t _1/2 av 6.01 tim) isotop som avger gammastrålning och kan internaliseras av celler i närvaro av den lipofila föreningen hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO). Dessa egenskaper gör den idealisk för användning i kliniker nukleärmedicinska för diagnos av många olika sjukdomar. Ödet för de märkta cellerna kan följas på kort sikt (upp till 36 h) genom gammascintigrafi att kvantifiera både antalet celler kvarhållna i lesionen och distributionen av cellerna i lungorna, sköldkörtel och andra organ. Denna teknik är anpassad från märkning av blodleukocyter och skulle kunna användas för att avbilda implanterat BMMSC i andra organ.

Introduction

Regenerativa strategier för reparation av sjuka eller skadade vävnader är baserade på multipotenta stamceller erhållna från en mängd olika vävnader och implanterades i det drabbade området. Nya framsteg i tillämpningen av autologa BMMSC för behandling av sen- och ligamentskador i hästen har visat förbättrade resultatmått i både experimentell ^1-5 och kliniska studier ^6. Hästen är en särskilt attraktiv modell för att bedöma effekten av stamcellsrelaterade behandlingar, eftersom det lider av ålder och överansträngning relaterade skador på senor i distala forelimb, är det en atletisk djur, och det är en stor, underlätta benmärgs återhämtning och korrekt implantation. Senskador läka naturligt med fibros men läkt senan är funktionellt sämre ⁷ och har en hög risk för re-skada ^8. Den ytliga digitala flexor senan (SDFT) är oftast påverkas eftersom det har utvecklats för att fungera som en elastisk energilagra och erfarenheter hög belastning betonar att åstadkomma energieffektiv och hög hastighet förflyttning. Återställa funktion efter skada är därför avgörande. Dessa skador liknar de som påverkar hälsenan hos människor och som ger en liknande funktion ^9. Det finns inga bra behandlingsalternativ för att behandla eller uppnå gott skick för sådana skador, därför cellbaserade regenerativa strategier erbjuder en attraktiv möjlighet att förbättra resultaten och minska åter skada.

I de flesta studier fem – 20 miljoner autolog BMMSC injiceras direkt in i lesionen som vanligtvis uppträder i kärnan av senan organ som således fungerar som en behållare för cellerna. Ödet för cellerna en gång injicerats är inte klart och olika cellmärkningsmetoder för att spåra celler har beskrivits nyligen. Celler märkta med en fluorescens tag visade sig överleva endast i relativt små mängder (<10%) ^10,11. Fluorescens etiketter nödvändiggörvävnads utvinning och sektionering för histologisk analys som är tidskrävande och inte underlättar lätt temporal analys i en stor djurmodell eller i kliniska fall. I senare arbete har vi använt radioisotopen ^99mTc att märka celler och följa deras öde genom gammascintigrafi ^1. Denna metod gör det möjligt för snabba jämförelser mellan olika vägar cell leverans, inklusive intralesional, intravenösa via halsvenen ¹ eller regional perfusion via intra-arteriella ¹² eller intravenösa ^1,12 injektioner. Persistens och distribution av celler kan sedan avbildas av gammascintigrafi av olika organ. Detta har visat att endast 24% av cellerna injicerade intralesionalt kvar i skadan med 24 tim ¹ och detta stöds av en annan studie med experimentellt skapade skador och använda samma radiomärkning ^5. Dessutom cellerna visar begränsad förmåga att hem till senor skador när delivered genom regional perfusion eller intravenöst men sprids i lungorna av de sistnämnda ^linjerna 4.

BMMSC märkta med järn nanopartiklar är en alternativ metod för att spåra celler implanterade i forelimb senor ^13. Även om järn nanopartiklar märkta celler tillåter spårning cell in vivo genom MRI, är temporala studier i ett stort djur begränsas av antalet gånger anestesi kan administreras vid varje tidpunkt för att utföra de MR-undersökningar. Vidare järn nanopartiklar är hypointense på MR som begränsar informationen på migrationen av märkta celler in i senan kroppen. Andra radioisotoper som kan användas innefattar indium-111, men detta lider av nackdelen av en längre halveringstid än Tc-99m (2,8 dagar vs 6,0 h) och högre gammastråleenergiemission. Dessutom har cellviabilitet rapporterats att minska när de är märkta med indium-111 ^14. Tc-99m, å andra sidan, används rutinmässigt i både häst och human nukleärmedicin att märka perifera mononukleära blodkroppar och följa deras fördelning in vivo genom scintigrafi. Det kan vara relativt lätt tas upp av celler med användning av HMPAO som en kopplingsmolekyl för att binda teknetium, såsom Tc-99m-HMPAO, till celler. Tc-99m-HMPAO märkt BMMSC visa god lönsamhet och kan föröka sig in vitro ^4. Detta protokoll detaljer märkning och spårning av häst autolog BMMSC implanteras i naturligt förekommande lesioner i forelimb SDFT.

Det är viktigt att notera att protokollet är endast avsett att användas som ett forskningsverktyg. Dess användning som en klinisk terapeutisk modalitet rekommenderas inte eftersom effekten av radiomärkningen på cellulära fenotypen är inte helt klarlagd.

Protocol

De fall som beskrivs häri utfördes efter etiska tillstånd från djuretik och välfärd kommitté Colegio de Veterinarios de Málaga, Spanien, och Royal Veterinary College, North Mymms, UK De metoder som används på hästarna är baserade på godkända protokoll som är används kliniskt på hästar som får stamcellsbaserade terapier som inkluderar sedering, benmärg aspiration, intra-tendinöst injektion, regional perfusion, intravenös injektion, efter procedur behandling och smärtlindring och uppföljning efter …

Representative Results

Tc-99m-HMPAO inkorporering i BMMSs inte påverkar deras förmåga att hålla sig till vävnadsodlingsplast och medan de visar spridning förmåga att bilda monolager (Figur 1) Vi har inte helt fastställt om spridningstakten eller någon annan cellulära fenotyper påverkas. Deras morfologi liknar omärkta celler med en typisk spindelform. Den cellulära märkningseffektiviteten (dvs.., Upptag av märkning) varierar typiskt från cirka 1,5% till 25%. Den främsta orsaken till den låga effektiv…

Discussion

Förutom benmärg stamceller som isolerats från källor såsom fettväv är lämpliga för märkning med detta protokoll. Dessutom kan celler från ett fryst tillstånd återupplivas och expanderas i odling till de önskade nummer för märkning studier ^12.

En kritisk faktor som bestämmer effektiviteten av märkning av BMMSC är tiden mellan elueringen av Tc-99m från molybdengenerator vid radiopharmacy, framställning av Tc-99m-HMPAO och användning av radiofarmakonet i klinike…

Materials

Technetium99m			Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements.  The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator
Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO)	GE HealthCare		Please enquire directly with GE HealthCare
Microfuge, Minispin/Minispin Plus	Ependorf	22620100
18G and 19G Needles	Terumo Medical	NN-1838R (18G);         NN1938R (19G)
Syringes 1 mL and 2 mL	Scientific Laboratory Supplies Ltd	SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Greiner Bio-One Ltd	616201
PBS – Phosphate-Buffered Saline	LifeTechnologies	14190
Sterile Gauze Swabs	Shermond Ltd	UNG602
CoflexVet self adhering bandage	Andover Healthcare, Inc.	3540RB-018
Ultrasound imaging software	Scion Image, Scion Corporation, USA
MicasXplus Scintigram processing software	Bartec Technologies Ltd		http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html
Field isotope counter for monitoring isotope	John Caunt U.K.	GMS1800a	http://www.johncaunt.com/
Well counter for isotope measurements, dose calibrator	Capintec Southern Scientific	CRC-25R