عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
خلال العدوى والالتهابات، وحيدات تعميم مغادرة مجرى الدم وتنتقل إلى أنسجة، حيث تفرق في الضامة. الضامة تعبر عن سطح مستقبلات تول مثل (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية الحفظ من خلال التطور في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة. TLRs تلعب دورا محوريا في تنشيط البلاعم التي عادة ما يرتبط التعبير الجيني التغيير. الضامة حاسمة في كثير من الأمراض، وقد ظهرت كما أهدافا جذابة للعلاج. في بروتوكول التالية، وصفنا إجراء لعزل الضامة البريتوني في الفئران باستخدام المتوسطة thioglycollate بيرة. وهذا الأخير سوف تعزز الهجرة الوحيدات في الصفاق، وفقا لهذا سيرفع العائد بلعم بنسبة 10 أضعاف. وقد أجريت العديد من الدراسات باستخدام نخاع العظم والطحال أو البريتوني المستمدة الضامة. ومع ذلك، فقد أظهرت الضامة البريتوني لتكون أكثر نضجا على العزلة وأكثر استقرارا في الوظيفيةإيتي والنمط الظاهري. وبالتالي، الضامة معزولة عن التجويف البريتوني الفئران تعرض السكان خلية الهام الذي يمكن أن تخدم في مختلف الدراسات المناعية والتمثيل الغذائي. مرة واحدة معزولة، وحفز الضامة مع يغاندس TLR مختلفة، وبالتالي تم تقييم التعبير الجيني.
Introduction
ويتكون النظام أكلة شبكية من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المختلفة مثل نخاع العظام والدم والكبد والطحال. يتم توزيع الضامة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم، حيث يشارك خصوصا في فطرية وقابلة للتكيف الاستجابات المناعية للسيطرة على العدوى واضحة. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، الضامة أيضا أن تلعب دورا هاما في شفاء الجروح والحفاظ على النسيج التوازن 1،2. وعلاوة على ذلك، الضامة ليست مهمة فقط لعمل جهاز المناعة ولكن أيضا تشارك بنشاط في الحديد التوازن 3. في الجسم، ما يقرب من 80٪ من الحديد موجودة في الهيموجلوبين في كريات الدم الحمراء، والتي عندما يتم هضم هرمة الضامة 4. يوميا، هذه الضامة إعادة تدوير 25 ملغ من الحديد المشتق من كرات الدم الحمراء وتوفير وسائل النقل لفي البلازما 5. وعلاوة على ذلك، خلال العدوى والالتهابات، الضامة الموالية للالتهابات تصادر الحديد في الدم للحد من availabili الحديدتي واي لمسببات الأمراض، على الصعيدين النظامية والمحلية 6-8. كذلك، فقد أظهرت الدراسات أن الضامة وأساسا خلايا الكبد تنتج الببتيد مضادات الميكروبات اسمه hepcidin الذي يعتبر المنظم الرئيسي لاستقلاب الحديد 9، 10. يتم زيادة Hepcidin أساسا من محفزات للالتهابات ويكون مسؤولا جزئيا عن عزل الحديد في بلعم على التهاب مزمن 11-13. كما لم يتم فهم التعبير hepcidin في الضامة بشكل جيد للغاية، درسنا الدور المحتمل للمستقبلات تول مثل (TLRs) في هذه اللائحة. تم العثور على TLRs في المقام الأول على الضامة، وتلعب دورا محوريا في تفعيلها. بالإضافة إلى ذلك، LPS hepcidin الناجم عن التعبير في الكبد يعتمد على TLR4 13. لذلك، لتنفيذ دراستنا، استخدمنا طريقة تقوم على عزل الضامة البريتوني في الفئران.
وتستخدم خطوط الخلايا البلعمية على نطاق واسع في استيلاد بلعمالمنشأ. مع ذلك يمكن أن ثقافة ممتدة يثير فقدان الجينات وانخفضت وظائف المناعة في هذه خطوط الخلايا. وبالتالي، عزل الضامة من التجويف البريتوني أمر بالغ الأهمية.
يعرض التجويف البريتوني الماوس موقع مثالي لحصاد الضامة 13-15. المعزولة الضامة البريتوني الفئران هي مريحة لعدة دراسات حول وظيفتها المناعية. ومع ذلك، فإن عدد الضامة في الصفاق غير كاف لدراسات مستفيضة ويقدر حوالي 1 × 10 6 الضامة في الماوس. وهكذا، لزيادة الانتاج بلعم، تم حقن عامل انتزاع معقمة مثل thioglycollate في التجويف البريتوني التي تسبق الحصاد الخلية. بعد حقن thioglycollate، تم زيادة العائد من الضامة في الماوس بنسبة 10 أضعاف. على الرغم من الزيادة في العائد الضامة، أعمال متوسطة thioglycollate بيرة كما مصدرا للإزعاج الذي يسبب استجابة التهابية، مما أدى إلى توظيف الضامة، والتي أماهذ لكن ليس من الضروري تؤثر على التعبير الجيني. وبالتالي، يجب أن تدرج مجموعة مراقبة تتكون من الضامة غير المعالجة في كل تجربة. في أيدينا، لم يتم الكشف عن التعبير hepcidin التي يتم تحفيز كبير من قبل التهاب في thioglycollate غير المعالجة أثارت الضامة البريتوني. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن thioglycollate بيرة تجند العديد من الضامة، ولكن لا تفجيرها 16. من جهة أخرى، أثارت thioglycollate بيرة أظهرت الضامة زيادة في انزيم الليزوزومية لكن انخفاضا في قتل الكائنات الحية الدقيقة بلعها 17. ومع ذلك، لم تتأثر القدرة أكلة بالمقارنة مع الضامة غير استخلاصها 16.
مرة واحدة مثقف في أطباق، الضامة البريتوني تصبح ملتصقة، وبالتالي السماح فصلهم عن نوع آخر من الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني. وفي وقت لاحق، وقد تم الطعن الضامة معزولة مع منبهات TLRs مختلفة.وأخيرا، تم استخراج مرنا من الخلايا المستزرعة وتم تحليل التعبير الجيني باستخدام كمية عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
الضامة هي الحاسمة من أجل البقاء وتوفر هدفا مغريا للتلاعب المضيف لتحقيق أهداف المناعية. وقد أجرى اكتشاف TLRs والجزيئات الأخرى الاعتراف الضامة لمحور النقاش المناعية. الضامة تستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات، بما في ذلك السيتوكينات، الجزيئات المرتبطة الضرر الجزيئية نم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، منح أي 298515-2011). AL وهو حاصل على درجة الدكتوراه وأيد منحة دراسية من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وMS من منحة مقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR، منح رقم MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Riferimenti
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
