Isolement d'anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Lors de l'infection et l'inflammation, les monocytes circulants quittent la circulation sanguine et migrent dans les tissus, où ils se différencient en macrophages. Les macrophages expriment des récepteurs de surface Toll-like (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires conservés à travers l'évolution dans une large gamme de micro-organismes. TLR jouent un rôle central dans l'activation des macrophages qui est généralement associée à l'expression du gène altération. Les macrophages sont essentiels dans de nombreuses maladies et sont apparus comme des cibles attrayantes pour la thérapie. Dans le protocole suivant, nous décrivons une procédure d'isoler les macrophages péritonéaux murins en utilisant un milieu thioglycollate de Brewer. Ce dernier va stimuler la migration des monocytes dans le péritoine, en conséquence, cela posera des macrophages rendement de 10 fois. Plusieurs études ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse, la rate ou péritonéale macrophages dérivés. Toutefois, les macrophages péritonéaux sont avérés plus mature sur l'isolement et sont plus stables dans leur fonctionnellité et le phénotype. Ainsi, macrophages isolés de la cavité péritonéale murin présentent une population de cellules importantes qui peuvent servir dans différentes études immunologiques et métaboliques. Une fois isolé, les macrophages ont été stimulées avec les différents ligands de TLR et par conséquent l'expression génique a été évaluée.
Introduction
Le système réticulo-endothélial phagocytaire est composé de cellules dans différents tissus et organes tels que la moelle osseuse, le sang, le foie et la rate. Les macrophages sont largement distribués autour du corps, où ils participent notamment à des innées et adaptatives des réponses immunitaires à contrôler et infections claires. En plus de leur rôle dans la défense de l'hôte, les macrophages jouent également un rôle important dans la cicatrisation des plaies et dans le maintien de l'homéostasie tissulaire 1,2. En outre, les macrophages ne sont pas seulement importants pour la fonction immunitaire, mais participent aussi activement à l'homéostasie du fer 3. Dans le corps, environ 80% de fer est présent en hémoglobine dans les erythrocytes, qui, lorsqu'il est sénescente sont phagocytés par les macrophages 4. Quotidien, ces macrophages recyclent 25 mg de fer érythrocytaire dérivés et fournissent son transport dans le plasma 5. En outre, lors de l'infection et l'inflammation, les macrophages pro-inflammatoires séquestrent le fer sérique de réduire availabili de ferty aux pathogènes, aux niveaux systémiques et locaux 6-8. En outre, des études ont montré que les macrophages et hépatocytes produisent principalement un peptide antimicrobien appelé hepcidine qui est considéré comme le maître régulateur du métabolisme du fer 9, 10. L'hepcidine est principalement augmenté par des stimuli inflammatoires et est partiellement responsable de la séquestration du fer dans les macrophages sur l'inflammation chronique 11-13. Comme expression de l'hepcidine dans les macrophages est pas très bien compris, nous avons étudié le rôle possible des récepteurs Toll-like (TLR) dans le présent règlement. Les TLR se trouvent principalement sur les macrophages et jouent un rôle central dans leur activation. En outre, le LPS induit l'expression de l'hepcidine dans le foie dépend de TLR4 13. Par conséquent, pour exécuter notre étude, nous avons utilisé une méthode basée sur l'isolement des macrophages péritonéaux murins.
lignées de cellules macrophages sont largement utilisés dans le goujon macrophagess; néanmoins culture prolongée peut provoquer la perte du gène et une diminution de la fonction immunitaire dans ces lignées cellulaires. Ainsi, l'isolement des macrophages de la cavité péritonéale est crucial.
La cavité péritonéale de la souris présente un site idéal pour la récolte macrophages 13-15. Macrophages péritonéaux murins isolés sont commode pour plusieurs études concernant leur fonction immunologique. Cependant, le nombre de macrophages dans le péritoine est insuffisante pour des études approfondies et est estimée à environ 1 x 10 6 par souris, des macrophages. Ainsi, pour augmenter la production de macrophages, un agent provoquant stérile tel que de thioglycolate ont été injectés dans la cavité péritonéale précédant la récolte des cellules. Après injection thioglycollate, le rendement des macrophages par souris a été augmenté de 10 fois. Malgré l'augmentation du rendement des macrophages, des actes moyennes thioglycollate Brewer comme un irritant qui induit une réponse inflammatoire, résultant dans le recrutement des macrophages, qui may mais pas nécessaire affectent l'expression des gènes. Par conséquent, un groupe de contrôle constitué de macrophages non traités doit être inclus dans chaque expérience. En nos mains, l'hepcidine expression qui est fortement stimulée par l'inflammation n'a pas été détecté dans thioglycolate non traité suscité des macrophages péritonéaux. En outre, des études ont montré que la thioglycollate Brewer recrute de nombreux macrophages, mais ne les active pas 16. D'autre part, le thioglycolate de Brewer a suscité macrophages ont montré une augmentation des enzymes lysosomales, mais une diminution de tuer les microorganismes ingérés 17. Cependant, la capacité de phagocytose n'a pas été affectée par rapport aux macrophages non provoquée 16.
Une fois cultivées dans des boîtes, les macrophages péritonéaux deviennent adhérentes, permettant ainsi leur séparation d'avec d'autres types de cellules isolées à partir de la cavité péritonéale. Par la suite, les macrophages isolés ont été exposés à différents agonistes TLR.Enfin, l'ARNm a été extrait des cellules cultivées et l'expression des gènes a été analysée en utilisant une réaction en chaîne transcriptase-polymerase inverse quantitative (qRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Les macrophages sont cruciales pour la survie et fournissent une cible tentante pour manipuler l'hôte pour objectifs immunologiques. La découverte des TLR et d'autres molécules de reconnaissance ont mené les macrophages au centre du débat immunologique. Les macrophages répondre à une variété de stimuli, y compris des cytokines, des molécules associées à des dommages moléculaires amortit motif (20) et des molécules associées à des groupes d'agents pathogènes (PAMP) 21. C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et (CRSNG, accorder aucune 298515-2011). AL est le récipiendaire d'un doctorat bourse du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et, MS et a été soutenu par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC, accorde pas. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Riferimenti
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