Isolering av Murina peritoneala makrofager att utföra genuttrycksanalys Vid Toll-like receptorer Stimulering
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Under infektion och inflammation, cirkulerande monocyter lämnar blodet och vandrar in i vävnader, där de skiljer i makrofager. Makrofager uttrycker yt Toll-liknande receptorer (TLRs), som känner igen molekylära mönster konserverade genom evolutionen i ett brett spektrum av mikroorganismer. TLRs spelar en central roll i makrofagaktivering som vanligtvis förknippas med genuttryck ändring. Makrofager är avgörande för många sjukdomar och har visat sig vara attraktiva mål för terapi. I följande protokoll, beskriver vi ett förfarande för att isolera murina peritoneala makrofager med användning av Brewers tioglykolatmedium. Den senare kommer att öka monocyt migration i bukhinnan, följaktligen kommer detta att öka makrofag avkastning med 10-faldigt. Flera studier har utförts med användning av benmärg, mjälte eller peritoneala makrofager. Emellertid var peritoneala makrofager visade sig vara mer mogna vid isolering och är mer stabila i sina funktionellaten och fenotyp. Således, makrofager som isolerats från mus bukhålan presentera en viktig cellpopulation som kan tjäna i olika immunologiska och metaboliska studier. När isolerade, var makrofager stimulerades med olika TLR ligander och därmed genuttryck utvärderades.
Introduction
Det retikuloendoteliala fagocytiska systemet består av celler i olika vävnader och organ, såsom benmärg, blod, lever och mjälte. Makrofager distribueras i stor utsträckning i kroppen, där de bland annat delta i medfödda och adaptiva immunsvar för att kontrollera och klara infektioner. Förutom deras roll i värdförsvar, makrofager spelar också en viktig roll vid sårläkning och för att bibehålla vävnadshomeostas 1,2. Dessutom, makrofager är inte bara viktigt att immunförsvaret utan också aktivt delta i järn homeostas 3. I kroppen, är cirka 80% av järn som finns i hemoglobin i erytrocyter, som när åldrande fagocyteras av makrofager 4. Dagligen dessa makrofager återvinna 25 mg erytrocythärledd järn och ge dess transport in i plasmat 5. Dessutom, under infektion och inflammation, pro-inflammatoriska makrofager binda serumjärn för att minska järn availability för patogener, både på systemiska och lokal nivå 6-8. Som väl, har studier visat att makrofager och främst hepatocyter producerar en antimikrobiell peptid som heter hepcidin som anses vara huvudregulator av järn metabolism 9, 10. Hepcidin främst ökade med inflammatoriska stimuli och är delvis ansvarig för järn upptag i makrofager vid kronisk inflammation 11-13. Som hepcidin uttryck i makrofager inte mycket väl förstått, studerade vi den eventuella rollen av Toll-liknande receptorer (TLR) i denna förordning. De TLRs finns främst på makrofager och spelar en central roll i deras aktivering. Dessutom är LPS-inducerad hepcidin expression i levern beroende TLR4 13. Därför att utföra vår studie har vi använt en metod baserad på isoleringen av murina peritoneala makrofager.
Makrofagcellinjer är i stort sett används i makrofager studer; ändå förlängd kultur kan framkalla gen förlust och minskad immunfunktioner i dessa cellinjer. Sålunda är avgörande isolering av makrofager från peritonealhålan.
Musen bukhålan utgör en idealisk plats för att skörda makrofager 13-15. Isolerade murina peritoneala makrofager är bekvämt för flera studier om deras immunologiska funktion. Dock är otillräcklig för omfattande studier antalet makrofager i peritoneum och beräknas cirka 1 x 10 6 makrofager per mus. Således, för att höja makrofag utgång framställdes en steril framkallande medel såsom tioglykolat injiceras i peritonealhålan föregår cellskörden. Efter tioglykolat injektion, var utbytet av makrofager per mus ökade med 10-faldigt. Trots ökningen av makrofager utbyte Bryggeri tioglykolatmedium fungerar som en irriterande som inducerar ett inflammatoriskt svar, vilket resulterar i rekryteringen av makrofager, som may men inte nödvändigt påverkar genuttrycket. Följaktligen måste en kontrollgrupp bestående av icke-behandlade makrofager inkluderas i varje experiment. I våra händer, var hepcidin uttryck som är mycket stimuleras av inflammation detekterades inte i icke-behandlade tioglykolat framkallade peritoneala makrofager. Dessutom har studier visat att Brewer s tioglykolat rekryterar många makrofager, men inte aktivera dem 16. Å andra sidan, Brewer tioglykolat framkallade makrofager visade en ökning av lysosomala enzymet men en minskning i att döda ingested mikroorganismer 17. Men var fagocytiska kapaciteten inte påverkas när jämfört med icke-framkallade makrofager 16.
När odlades i skålar, de peritoneala makrofagerna blir vidhäftande, därför möjliggör deras separation från andra typer av celler isolerade från den peritoneala kaviteten. Därefter fick de isolerade makrofager utmanade med olika TLRs agonister.Slutligen tillsattes mRNA extraherat från de odlade cellerna och genuttryck analyserades med användning av kvantitativ omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrofager är avgörande för överlevnad och ger en frestande mål att manipulera värd för immunologiska mål. Upptäckten av TLRs och andra igenkänningsmolekyler har genomfört makrofagerna till mitten av immunologiska debatt. Makrofager svara på en mängd olika stimuli, inklusive cytokiner, skadeassocierade molekylära mönster molekyler (dämpas) 20 och molekyler som är förknippade med grupper av patogener (PAMPs) 21. Dessa olika stimuli svar representerar loppet av makrofager aktivering…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC bevilja ingen 298.515-2011). AL är mottagare av en Ph.D. stipendium från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC), och MS fick stöd från ett bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR bevilja nej. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Riferimenti
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
