Культивирование мыши сердечных клапанов в миниатюре культуры тканевой системе
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Болезнь сердца клапан является основной причиной заболеваемости и смертности в западном мире; его распространенность увеличивается с возрастом, и это влияет на более чем 10% населения 75 лет и старше 1. Клапаны системной части сердца, аортального и митрального клапанов, в основном пострадали. Сердечно-сосудистые заболевания клапанов характеризуется потерей высокоорганизованной структуре клапанов, что приводит к изменению механических свойств 2. Структурная целостность Поэтому крайне важно для функции клапана.
Створки клапана состоят из клапанов интерстициальных клеток (ВМЦ), клапанов эндотелиальных клеток (VEC), и внеклеточного матрикса, который высоко организованной в слоистой рисунком 3,4. ВИК отвечают за синтез ЕСМ, деградации и организации. Факторы, исходящий из крови, ЭК или проживающих в ECM действуют на ВИНК оркестровки свою функцию. В дополнение,механические силы действуют на листовке во время сердечного цикла, в результате чего ламинарный или колебательного напряжения сдвига, сжатия или растягивающих напряжений, влияющих на поведение ВИНК 5.
Для того, чтобы понять, как структура клапана регулируется, то сначала следует понимать, как ВИНК реагировать на разнообразный набор стимулов опытных во время сердечного цикла. В пробирке исследования были очень информативными о характеристиках и способностях клапанов клеток. Реакция этих клеток в пробирке, однако, может не всегда точно имитировать ответ в естественных условиях 6; Например, реакция на раздражители VIC зависит от наличия ЭК и ECM состава 5. Кроме того, реакция клапанного клеток на стимулы, зависит от их конкретного места в листовке 7. В дополнение к биохимических раздражителей, поведение клапанных элементов определяется механическими силами, действующими Oп клапан 8. Каждая область клапана подвергается ее собственный набор гемодинамических нагрузок. Хотя нынешние экс естественных условиях модели показали, что механические силы являются важными факторами, определяющими структуру клапанов 5, связанные механизмы до сих пор неясно. В то время как модели в естественных условиях обеспечили понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе развития клапанной 9,10, способность проникновения в суть взрослых клапанной биологии до сих пор не удается.
Таким образом, экс виво модель потока была разработана в котором клапаны сердца могут быть культивированы в их естественном положении в центре в течение длительного периода времени 11. Это имеет то преимущество, что клапаны остаются в их естественной конфигурации и ИКС испытать ту же среду, что и в естественных условиях, что делает ответов на стимулы VICS как можно более естественным. Кроме того, культура клапанов в их естественном положении в центре облегчает подвергая другклапанов регион соответствующих гемодинамики напряжений. В этом экс виво модели, т.е. Миниатюрный культуры ткани Система (MTCS), клапаны могут быть подвергнуты различным биохимическим и гемодинамических стимулов, позволяющих исследование их роли в ремоделирования сердца клапана.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в культивировании клапаны мыши сердечные включают создание времени между удалением сердца от мыши и лигирование в перфузионной камеры как можно короче, чтобы обеспечить жизнеспособность и лигирование иглы перпендикулярно к клапанам, чтобы обеспечить надлежащее нап…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
Riferimenti
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
