Chirurgische Verletzung des Maus-Pankreas durch Ligatur des Pankreasganges als Modell für endokrine und exokrine Reprogrammierung und Proliferation
Summary
This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
Abstract
Ausbau der pankreatischen Betazellen in vivo oder ex vivo, oder die Erzeugung von Beta-Zellen durch die Differenzierung von embryonalen oder adulten Stammzellen können neue erweiterbare Quellen von Beta-Zellen, um die Spenderknappheit in der menschlichen Inseltransplantation als Therapie für Diabetes zu lindern. Obwohl die jüngsten Fortschritte auf dieses Ziel gemacht, Mechanismen, die Beta-Zell-Expansion und Differenzierung von einer Stamm- / Vorläuferzellen regulieren bleiben zu charakterisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen Verletzungsmodell in der erwachsenen Maus Bauchspeicheldrüse, die als Werkzeug zum Mechanismen Geweberemodellierung und Beta-Zellproliferation und Differenzierung zu studieren funktionieren kann. Teilkanal Ligatur (PDL) ist eine experimentell induzierte Schädigung des Nagetier Pankreaszystadenom chirurgische Ligation des Bauchspeicheldrüsenhauptgang, was zu einer Verstopfung der Drainage exokriner Produkte aus dem Heckbereich des Pankreas. Der zugefügte Schaden induziert acinar Atrophie, Immunzelle infiltration und schwere Gewebeumbau. Wir haben bereits berichtet, die Aktivierung von Neurogenin (NGN) 3 exprimierenden endogenen Vorläufer-ähnlichen Zellen und eine Erhöhung der beta-Zellproliferation nach der PDL. Daher stellt PDL eine Grundlage, um Signale in der Betazelldynamik involviert und die Eigenschaften eines Hormonvorläufer in adulten Pankreas studieren. Da bleibt es weitgehend unklar, welche Faktoren und Signalwege tragen zur Beta-Zell-Neubildung und Proliferation in PDL wird ein standardisiertes Protokoll für PDL zum Vergleich in Labors zu ermöglichen.
Introduction
Die zunehmende Prävalenz von Diabetes, die mehr als 300 Millionen Menschen weltweit 1,2 hat die Suche nach neuen Quellen der Insulin-produzierenden Beta-Zellen verstärkt, sowohl in vitro als auch in vivo, um die mangelhafte Betazellmasse wieder aufzufüllen. 3 bezeichnet die Schlüsselfiguren Mechanismen und Faktoren, die Beta-Zellproliferation und der Betazellneubildung, dh, die Differenzierung von B-Zellen vor einer Nicht-Beta-Zellen oder Vorläuferzellen regulieren können neue Ziele für die Entwicklung von Diabetes in regenerativer Therapien bereitzustellen.
In den Entwicklungs Nagetier Pankreas, alle der endokrinen Zelltypen aus einer Population von transienten endokrine Vorläuferzellen, den Transkriptionsfaktor Neurogenin3 (Ngn3) exprimieren. 4,5 Im erwachsenen Nager Pankreas, unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Betazellmasse bei einer optimalen Zahl gehalten, um Stoffwechselanforderungen zu erfüllen. Änderungen in der Beta-Zellgröße,Apoptose und Replikation sind die Hauptmechanismen für beta-Zellexpansion und turn-over. 6-8 wenn das Potenzial der Beta-Zellen, die unter normalen physiologischen Bedingungen vermehren sich im gesamten Population homogen, 9 ihre Proliferationsrate niedrig und Wieder Replikation durch eingeschränkt ein dynamischer Ruhe Zeitraum oder Refraktärzeit 6,7, nach Alter und Glukosestoffwechsel beeinflusst. 10 Da endokrine Vorläuferzellen wurden bisher nicht in der normalen erwachsenen Bauchspeicheldrüse identifiziert wird Neogenese gedacht, um nicht in den normalen Erwachsenen Beta-Zell-Wachstum beitragen. 8
Daher ist die Identifizierung eines fakultativen endokrine Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse, ausbaubar und erbringt die neuen beta-Zellen würde eine neue, möglicherweise unbegrenzte Quelle von Beta-Zellen zu liefern.
Teilkanal-Ligation (PDL) ist ein Tiermodell, das Verletzung beschrieben worden ist, um Beta-Zellen zu induzieren neogenesis im erwachsenen Bauchspeicheldrüse. 11,12 In diesem Modell wird die Hauptpankreasgang Ablassen des Pankreasschwanz operativ verknüpft. Die resultierende Behinderung der exokrinen Drainage induziert große Gewebeumbau, begleitet von Entzündung und Azinuszellen Atrophie distal zur Ligation. 12-14 In dieser entzündlichen Umgebung Reexpression des endokrinen Vorläufermarker Ngn3 induziert und die Beta-Zellvolumen erhöht zweifache . Diese Verdopplung in Betazellvolumen ergibt sich aus der Generation der neuen Beta-Zellen aus einer embryonalen Ngn3-type endokrine Vorläuferzellen und Proliferation von bereits bestehenden und neu gebildeten Beta-Zellen, die anfällig für ohne "Ruheperiode"-Duplizierung wieder sind Ausdruck zu bringen. 11,15
Beta-Zell-Neubildung und Replikation in Verletzung Modellen wie Pankreatektomie 6,7,16-19 und selektiver Ablation der Betazellen 20 sind ausführlich beschrieben. Allerdings ist die regenerative Ergebnis in these-Modellen wird durch das Ausmaß der Schäden beeinflusst und ist mit einer verringerten Ausgangsbetazellmasse 21 verbunden. PDL ist ein chirurgischer Modell, in dem die ersten Beta-Zellmasse ist nicht betroffen und Beta-Zell-Neubildung und Proliferation sind robust aktiviert. Tatsächlich im Pankreas von Mäusen, die PDL unterzog, Ngn3-exprimierenden Zellen in der Nähe der Epithelauskleidung des Kanals identifiziert. Diese Zellen können aus den ligierten Pankreas Ngn3-GFP-transgenen Mäusen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden und können gegenüber funktionellen beta-Zellen differenzieren folgenden Transplantation in und ex vivo Kultur der Bauchspeicheldrüse von E12.5 Ngn3 – / – . Mäuse 11 Ähnlich in Ngn3 CreERT;. R26 YFP Mäuse, bei denen Zellen, die Ngn3-Gen aktiviert werden permanent nach einer Tamoxifen-Injektion werden Label-positive Ngn3-Zellen abgeleiteten Beta-Zellen nach der PDL erfasst markierten 15 Außerdem neu gebildete Beta-Zellen zu verdünnen pre -existing Beta-Zellen und bevorzugt in kleinen Inseln, in dem Beta-Zellen zeigen eine hohe Proliferationspotential zu lokalisieren. 15 Ngn3 ist wichtig für die Beta-Zell-Expansion nach PDL seit verringert Ngn3-Expression unter Verwendung zielspezifische Kurzhaarnadel-RNA Betazellmasse und Beta-Zell-Proliferation nach deutlich verringert PDL. 11 Bemerkenswert ist, der Anteil an Ngn3 Zellen abgeleitete beta-Zellen und die Betazellmasse nach PDL hängt entscheidend von der Höhe der Induktions Ngn3 15. Dies ist im Einklang mit der Beobachtung, dass hohe Ngn3-Expression ist ein entscheidender Schritt für die endokrine Engagement von multipotenten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse bei Bauchspeicheldrüsenentwicklung 22 Darüber hinaus selektive Ablation von Ngn3-exprimierenden Zellen von Diphtherie-Toxin Verabreichung an Ngn3 CreERT;. R26 IDTR Mäuse führt zu einer verringerten Insulingehalt und verminderte beta-Zellproliferation, insbesondere bei kleinen Inseln. 15
<pclass = "jove_content"> Obwohl die Induktion von Ngn3-Expression in Gangzellen nach der PDL ist von vielen 11,15,16,23,24 bestätigt, Ngn3-Expression in Inselzellen 24,25 und Diskrepanzen im Ergebnis der PDL in Frage gestellt unseren ersten Beobachtungen erhöhter Betazellmasse 26,27, Aussehen Ngn3 ausdrücken Kanal stamm endokrine Vorläuferzellen 24,26,28,29 und erhöhte Beta-Zell-Proliferation 27 nach PDL. 30Diese widersprüchlichen Ergebnisse könnten, zumindest teilweise, auf eine Kombination von Faktoren, einschließlich Variationen in den postoperativen Zeitpunkten der Analyse, Körpergewicht, Geschlecht und Alter der Mäuse, postoperative physiologischen und Umweltbedingungen und vor allem zurückzuführen, Unterschiede in der chirurgischen Technik. 30. In unseren Händen, beta-Zell-Proliferation, Insulingehalt, Betazellvolumen und die Anzahl der Inselchen konsequent nach PDL erhöht. AuchNgn3 mRNA konsequent erhöht, aber es gibt große Unterschiede in der Ngn3-mRNA-Expression zwischen PDL Schwanz Bauchspeicheldrüsen, für die wir keine direkte Erklärung. Wir nahmen an, dass die Höhe der Ngn3 mRNA könnte mit dem Grad der Beta-Zell-Neubildung aus Nicht-Beta-Zellen 15 zu korrelieren, aber das muss weitere Begründung. Obwohl es alle experimentellen Variationen nicht zu entfernen, ein standardisiertes Verfahren zur Durchführung PDL Operation ermöglicht eine bessere Einheitlichkeit Ergebnisse und eröffnet neue Wege bei der Untersuchung Beta-Zell-Proliferation und Neubildung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Materials
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
Riferimenti
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