HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of<em> Plasmodium</em> Rhoptry Proteiner

Summary

Uttrykk for malaria proteiner i cellebaserte systemer er fortsatt utfordrende. Vi viser to trinn og ett skritt IVT (in vitro oversettelse) celle gratis ekspresjonssystemer for å uttrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruker et Ni-resin affinitet baserte rensesystem for å rense rhoptry proteiner.

Abstract

Malaria forårsaker betydelig global sykelighet og dødelighet. Ingen rutine vaksine er tilgjengelig for øyeblikket. En av de viktigste årsakene til mangelen på en vaksine er utfordringen med å finne egnede vaksinekandidater. Malaria proteiner uttrykkes ved hjelp av prokaryote og eukaryote cellebasert ekspresjonssystemer er dårlig glykosylert, generelt uløselig og gjennomgå uriktig folding fører til redusert immunogenisitet. De hvetekim, kanin retikulocyttlysat og Escherichia coli lysat celle ytringsfrihet systemer brukes i dag for uttrykk av malaria proteiner. Men lengden av uttrykket tid og uriktig glykosylering av proteiner forblir fortsatt en utfordring. Vi demonstrerer uttrykk for Plasmodium proteiner in vitro bruker HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer, kalt "in vitro humane celle gratis ekspresjonssystemer". De to HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer transkribere mRNA i 75 min og 3 pl transcribed mRNA er tilstrekkelig til å oversette proteiner i 90 min. Den en-trinns-ekspresjonssystem er en transkripsjon og translasjon koplet ekspresjonssystem; transkripsjonen og co-oversettelse skjer i 3 timer. Fremgangsmåten kan også utvides i 6 timer ved å tilveiebringe ytterligere energi. I to-trinns-ekspresjonssystem blir transkribert mRNA først og deretter tilsettes til blandingen oversettelsen for proteinekspresjon. Vi beskriver hvordan å uttrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurer er Cleft – to trans (PfMC-2TM) protein, en hydrofil PF3D7_0925900 protein og en armadillo gjentar inneholder protein PF3D7_1361800, ved hjelp av HeLa basert celle ytringsfrihet system. Proteinene uttrykt i mikrovolumene som anvender to-trinns og en-trinns uttrykk strategier. En affinitetsrensing metode for å rense 25 ul av proteiner uttrykt ved hjelp av in vitro human cellefritt ekspresjonssystem er også beskrevet. Protein utbytte bestemmes av Bradford assay og uttrykteog rensede proteiner kan bli bekreftet ved western-blotting-analyse. Uttrykte, rekombinante proteiner kan bli brukt for immuniseringer, immunologiske analyser og proteinsekvensering.

Introduction

I malaria forskning, ekspresjon av immunogene proteiner ved anvendelse av prokaryote eller eukaryote cellebaserte systemer er fortsatt en utfordring. AT rikdom av Plasmodium genomet og ukjente posttranslasjonell mekanismer ^14,7, bidra til vanskelighetene forbundet med å skaffe riktig brettet og immunogeniske proteiner for antistoffproduksjon og vaksinestudier. Prokaryote systemer, for eksempel Escherichia coli er blitt anvendt for rekombinant proteinekspresjon. Prokaryote systemer er rimelig, effektivt produsere høye utbytter av rekombinante proteiner og har flere Kloningsvektorene. Verts E. coli-celler er lett å omforme og celler vokse raskt. Men prokaryote systemer har begrensninger, for eksempel mangel aminosyresubstitusjon, post-translasjonell modifikasjon, risiko for forurensning, heterogene produkter og akkumulering av rekombinante proteiner i inklusjonslegemer ²⁴ av.

I enstudie av Mehlin et al. (2006), ble 1000 åpne leserammer (ORF) uttrykt. Ca 7% av de uttrykte proteiner ble ¹⁴ løselige. Uoppløseligheten observerte skyldes forspent arten av genene og den høye frekvensen av kodoner som benyttes ideelt sett av Plasmodium AT-rike genom ^14. En alternativ strategi for å overvinne dette problemet har blitt utviklet ved hjelp av plasmider eller vertsceller som inneholder tRNA som gjenkjenner sjeldne kodoner eller kodonene som svarer til ^tre frekvensene. Selv etter å ha utført disse optimaliseringer, er svært små deler av proteiner uttrykt som løselig, aktiv og immunogent ^14. De cellefrie ekspresjonssystemer inneholder alle de komponenter som er nødvendige for transkripsjon og translasjon, slik som ribosomer, initiering faktorer, forlengelse faktorer (oversettelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkripsjons- og translasjonselementer reaksjoner er koplet i ett-trinns prosedyre ^11,29. Den transcription Reaksjonen utføres i et rør før passende mengde av mRNA blir inkubert med oversettelse maskineri i et annet rør ^11,29. Selv om disse metodene har lykkes i Plasmodium sp. Proteinekspresjon, er en stor ulempe hvor lang tid for proteinekspresjon, som er ca. 22 timer ^29. I tillegg er den høye kostnaden av forbruksvarer for inkludering i protokollene ^29, er arbeidskrevende forberedelser av cellelysatet og inkonsistens i komponent preparater, gjør disse systemene uoppnåelig. Hovedfokus for forskere for utvikling av en celle ytringsfrihet system er avhengig av faktorer som for eksempel rask genmodifisering, raske avlinger med høye konsentrasjoner og rett frem lysat forberedelser ^1.

Eukaryote systemer slik som gjær, pattedyrcellelinjer, baculovirus mediert ekspresjonssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitt ekspresjonssystemer such som Leishmania har blitt brukt for rekombinant protein uttrykk ^7. Eukaryote systemer dele fylogenetisk forhold og derfor også dele egenskaper som glykosylering, Acyleringen, disulfidbindingen formasjon, anstand samhandling, proteolyse og sub-cellulære compartmentalization. Proteinsekresjon hendelser i eukaryoter hindre opphopning og reduserer giftighet for ekspresjonssystemer ^13. Bruken av gjærsystemer er foretrukket som de er egnet for protein ekspresjon i stor skala, og for å oppnå høye utbytter ^4. To P. falciparum proteiner PfCP-29 og Pvs25 ble produsert ved hjelp av gjær system ^4. Imidlertid er en stor ulempe i syntesen av de fleste av proteinene var uregelmessige N- og O-glykosyleringsmønstre, uriktig folding og avkutting av proteiner fra deres native form ^4.

Bruken av pattedyrceller for syntese av rekombinante proteiner er arbeidskrevende og den er kostbarSive å opprettholde stabile rekombinante cellelinjer ^4. Derfor har pattedyrceller vært begrenset til analyse av protein signalisering, protein interaksjoner og parasitt-vert interaksjoner og også for testing av DNA-vaksiner ^4. The Human DNA og mRNA in vitro protein ekspresjon cellefritt system som her er beskrevet er et HeLa celle-avledet pattedyr-basert system som uttrykker proteiner i 3 timer. Proteiner uttrykt ved hjelp pT7CFE1-Chis Ekspresjonsvektor har en C-terminal tag tilrettelegging identifisering og rensing. Den HeLa baserte systemet er supplert med translasjonsinitiering faktorer og en oversettelse regulator, og dermed øke effektiviteten til translasjonssystem. Proteiner kan raskt oversettes, screenet, verifisert og bearbeides for bruk i ulike immunologiske og strukturelle applikasjoner ^15.

Eukaryote cellefrie ekspresjonssystemer så som hvetespirer og kanin retikulocytt er for tiden anvendt for ekspresjon av Various eukaryote proteiner inkludert Plasmodium proteiner ^11,29. I tillegg E. coli-baserte cellefrie systemer er også anvendes for eukaryot protein ekspresjon ^11. Tabell 1 oppsummerer forskjellige cellefritt ekspresjonssystemer ved å sammenligne trekk ved de systemer så vel som den enkle å bruke systemer for proteinekspresjon. Den humane cellefrie system i forhold til de andre, har evnen til å utføre post og co-translasjonelle modifikasjoner, og er mindre kostbart. Kodon optimalisering er mulig, og alle reaksjonene kan utføres i 3 timer. HeLa-systemet er et ideelt system for oversettelse proteinsyntese i laboratoriet omgivelser.

En stor fordel med humane celle fri ekspresjonssystemer enn andre cellefrie systemer er tilgjengeligheten av flere forskjellige cellelinjer avledet fra forskjellige organer og vev. Flere varianter av cellefrie systemer kan utformes avhengig av cellelinjen. Ekstraktets avledet fra pattedyrceller har høyere effektivitet for å syntetisere store proteiner enn noen andre celle gratis ekspresjonssystemer. Disse celle ytringsfrihet systemer kan også brukes i diagnostiske og protein karakterisering applikasjoner som mikro arrays ^30. Den populære HeLa-cellelinjer som er mest brukt til å utføre ekspresjonen av proteiner ^33. Det endoplasmatiske retikulum i HeLa cellelinjer er underutviklet, som fører til fravær av post-translasjonell modifikasjon glykosylering aktivitet ^33. Imidlertid er dette systemet antas å være fordelaktig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium også mangler glykosylering stolpe oversettelses modifisering ^29. Den HeLa cellefrie transkripsjons-translation protokoll er enkel å utføre, billig og proteiner kan uttrykkes i 90 min, klar for rensing og videre nedstrøms applikasjoner.

Protocol

1. Utarbeidelse av parasitt cellekulturer, Innsamling av Parasite Pellets Forbered RPMI-1640-Hepes media ved å tilsette 10 g av RPMI-1640-pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbikarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxantin og 3,8 g dekstrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruker tabellen magnetrører til alt pulveret er oppløst i en L destillert vann. Utføre mikro filtrering av medier med 0,22 mikrometer filter. Oppbevar media i sterile flasker. Vask uinfiserte (frisk) type A …

Representative Results

Validering av de uttrykte rekombinante proteiner gjennom reaktivitet med spesifikke antistoffer er et viktig første skritt i å bekrefte riktig folding av de uttrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner ble uttrykt ved hjelp av et skritt og to trinn in vitro human celle ytringsfrihet systemer. De rekombinante proteiner er renset Ni-gelaterende affinitet metoden. Vi brukte antisera mot hele merozoit rhoptries i western blotting av SDS-PAGE separerte rekombinante proteiner. Figu…

Discussion

Det viktige trinn for vellykket ekspresjon av proteiner ved anvendelse av to-trinns in vitro human cellefritt ekspresjonssystem og rensing er: 1) vellykket amplifikasjon og kloning av gener i pT7CFE-chis plasmidvektor; 2) transkribere RNA ved 30 ^o C; 3) translasjon av proteinet ved 30 ° C i nærvær av RNase inhibitor; 4) utvikling av affiniteten baserte renseprotokoll ved bruk av harpikskuler belagt med Ni og 5) analyserer resultatene på western blot ved anvendelse av polyklonale og monoklonale antistoffer…

Materials

Two-step in vitro human cell free expression system	Thermo fischer	88856	Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
One-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80oC. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at room temperature
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4oC.