En optimalisert Enrichment teknikk for isolering av<em> Arthrobacter</em> Bakteriofag Arter fra jordprøve Isolerer

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

Ubiquity av Arthrobacter arter i jord miljøer tilbyr et stort antall og mangfold av fager i stand til å være isolert fra denne arten av verts bakterier. Bakterielle medlemmer av Acintobacteriaceae familien er mest kjent for sine katabolske veier av nedverdigende gjenstridige forbindelser som atrazine og diverse andre plantevernmidler og herbicides ^1,2,3. Selv om det meste av forskningen er gjort ved hjelp av miljø stammer av Arthrobacter, er kliniske isolater av denne slekten finnes i blod, urin, øyne, og mange andre menneskelige kilder alle viser fylogenetisk heterogenitet ^4.

Mens det er en ganske omfattende mengde forskning på Arthrobacter bakterier, bare noen få studier rapporterer om fagene i stand til å infisere medlemmer av denne mangfoldige slekten. Interessant om, arbeidet som er gjort tidligere på Arthrobacter fager berører flere sentrale forskjellige temaer som typing av jord <em> Arthrobacter arter ^5, industrielle bruksområder med det formål å redusere skadelig skum i aktivert slam renseanlegg ^6, og arbeidet fremhever stedsspesifikke rekombinasjon og integrasehemmere gener ^7.

Ulike berikelse teknikk protokoller har blitt ansatt for å generere ren fag isolerer i Arthrobacter arter. Tidlige prosedyrer inkluderer inkuberinger av jord med tilsatt giftige stoffer som nikotin salter for perioder på over ett år ⁸ gir opphav til fager som kan bare infisere A. globiformis. Studier gjort ved hjelp av jord perkolert med labile organiske syntes å gi målbare fager via plakkassay teknikker, utelate lange inkubasjonsperioder ^8. Interessant om, ble en teknikk ligner direkte plating brukt tidligere ga støtet til flere fag samtidig som de har en særlig lav suksessrate av etterforskerne ^5, siterer tidligere studier med lave suksessraten <sopp> 8.

Samlet, isolasjonsteknikker brukt tidligere var kjent for å ha liten effekt i praksis til tross for Arthrobacter slekten som representerer den vanligste aerobic jord isolere i naturen ^4,9,, Van Twest og Kropinski ¹⁰ nåværende berikelse metoder for å isolere fager fra vann og jord tilpasset fra tidligere teknikker som brukes til å berike miljø bakterieisolater men disse berikelse teknikker vist seg ineffektiv i å isolere Arthrobacter fager. Hensikten med fremgangsmåten beskrevet her er å vise "bevis på konseptet" at de tidlige berikelse metoder kan tilpasses til konsekvent og effektivt isolere Arthrobacter fager, overvinne tidligere tekniske utfordringer forbundet med å isolere fager fra dette bakteriell slekten.

Protocol

1. Utarbeidelse av Arthobacter Cells for Fag Isolation Kultur Arthrobacter sp. KY3901 kolonier streket på en Luria Bertaini (LB) agar plate inkubert ved 30 ° C i 2-3 dager. Plukk en koloni og bruke en steril sløyfe for å legge den til 250 ml LB buljong i en baffled kultur kolbe og inkuberes i en risting inkubator ved 225 rpm ved 30 ° C. Tillate ca 24 timer av vekst for å få sene eksponentiell / tidlig stasjonære fase celler for fag smitteforsøk. Overvåke tilstanden til ba…

Representative Results

Å demonstrere reproduserbarhet av forbedret berikelse teknikk for Arthrobacter fager, ble 30 forskjellige jordprøver brukes til forskjellige tider og steder i løpet av våren og sommeren 2014. Av disse 30 jordprøver unike Arthrobacter fager ble hentet fra 22 av innsamlede jordprøver ved hjelp av denne berikelse prosedyren. Standarden anrikningsfremgangsmåte ga unike fag fra tre av de samme jordprøvene. Anrikningen prøvene kan ha en meget høy fag-titeret ønsker initial fortynning for å isoler…

Discussion

Til tross for mange tidligere forsøk på å isolere fager i stand til å infisere Arthrobacter verter, hadde vi liten suksess ved hjelp av standard anrikningsfremgangsmåter. Generalisert metode for bakteriell berikelse utviklet og tilpasset av van Twest og Kropinski ¹⁰ å berike fager fra miljøprøver er fortsatt grunnlaget for de fleste av anrikningsfremgangsmåter. Bevis fra tidligere studier tyder på at metoder for direkte plating har produsert påvisbare plakater på stammer av Arthrobact…

Materials

LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824