Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Celler fra dyr, planter og enkelte celler er omgivet af en barriere kaldet cellemembranen, der adskiller cytoplasmaet udefra. Cellelag såsom epitel også danner en barriere, der adskiller indersiden fra ydersiden eller forskellige rum af flercellede organismer. Et centralt element i disse barrierer er forskellen fordeling af ioner på tværs af cellemembraner eller cellelag. To egenskaber tillader denne fordeling: 1) membraner og epiteler vise selektiv permeabilitet til bestemte ioner; 2) ioner transporteres gennem pumper over cellemembraner og cellelag. Disse egenskaber spiller afgørende roller i at opretholde væv fysiologi og fungere som signalering tidskoder efter skade, under reparation, eller under patologisk tilstand. Den ionselektive selvrefererende mikroelektrode tillader målinger af specifikke fluxe af ioner, såsom calcium, kalium eller natrium ved enkeltcelle-og vævsniveauer. Mikroelektrode indeholder en ionophor cocktail, som erselektivt permeabel for en bestemt ion. Den interne påfyldning opløsning indeholder et sæt koncentration af ionen af interesse. Det elektriske potentiale af mikroelektrode bestemmes af den udvendige koncentration af ionen. Som ionkoncentrationen varierer potentiale mikroelektrode ændrer sig som funktion af log af ionen aktivitet. Når bevæges frem og tilbage i nærheden af en kilde eller vask af ionen (dvs. i en koncentrationsgradient grundet ionflux) mikroelektrode potentiale svinger med en amplitude proportional med ionstrøm / gradient. Forstærkeren forstærker mikroelektrode signal og produktionen registreres på computer. Ion flux kan så beregnes ved Ficks lov om diffusion ved hjælp elektrodepotentialet udsving, udflugten af mikroelektrode, og andre parametre, såsom den specifikke ion mobilitet. I dette papir, vi beskriver i detaljer den metode til måling af ekstracellulære ion strømme ved hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode end præsentere nogle repræsentative resultater.
Alle animalske celler er omgivet af en dobbeltlaget lipidmembran, som adskiller cytoplasmaet fra det ydre miljø. Cellen opretholder et elektrisk membranpotentiale, negativ indvendigt af aktiv transport af ioner 1. Membranpotentialet er en lagret energikilde, som cellen kan bruge til at betjene forskellige molekylære enheder i membranen 2. Neuroner og andre exciterbare celler har store membranpotentialer. Hurtig åbning af natriumkanaler kollapser membranpotentialet (depolarisering) og producerer aktionspotentialet, der transporteres langs længden af neuron 2. Bortset fra disse hurtige elektriske forandringer, mange væv og organer generere og opretholde betydelige langsigtede elektriske potentialer. For eksempel, hud og hornhindens epitel generere og vedligeholde trans-epiteliale potentialer og ekstracellulære elektriske strømme ved retningsbestemt pumpning af ioner (hovedsagelig natrium og chlorid) 3.
telt "> Mens målinger af endogen ekstracellulære elektrisk strøm ved hjælp af vibrerende sonde 4-6 og målinger af membran- eller trans-epitel potentialer ved hjælp af mikroelektrode-systemet 7-10 tillade måling af de elektriske parametre for cellemembraner og epiteliale cellelag, giver de ikke angivelse af de ion involverede arter.Mikroelektroder med selektiv ionophor kan måle specifikke ion-koncentration i opløsning. Ion gradienter eller flux kunne måles med to eller flere elektroder på forskellige positioner. Den iboende spænding Forskydningen af hver probe, ville imidlertid være forskellige, hvilket forårsager unøjagtige målinger eller endda påvisning af en gradient, der ikke var til stede. En enkelt elektrode, der anvendes i "self-referering" -tilstand, hvorved den bevæger sig ved lav frekvens mellem to punkter løser dette problem. Nu ion flux kan ses på baggrund af en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). </p>
Den ion-følsomme måle system bruger ionselektive selvrefererende mikroelektroder at detektere små ekstracellulære fluxe af ioner tæt på væv eller enkeltceller. Systemet består af en forstærker, som behandler signalet fra mikroelektroden og en mikro stepmotor og driver til at styre bevægelsen af mikroelektrode. Den ionselektive mikroelektrode og referenceelektroden, der lukker kredsløbet er forbundet til forstærkeren via en hovedtrin forforstærker (figur 1A). Computersoftware bestemmer parametrene for mikroelektrode bevægelse (frekvens, afstand) og også registrerer udgangen af forstærkeren. Stepmotor styrer mikroelektrode bevægelse via en tredimensional micropositioner. En lav frekvens vibrerende ionselektiv mikroelektrode blev først udviklet i 1990 for at måle specifik calciumflux 11. Samt calcium, kommercielt tilgængelige ionofore cocktails er nu tilgængelige at gøre microelectrodes følsom over for natrium, chlorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, lithium eller kviksølv.
Grundlæggende selvrefererende ionselektiv mikroelektrode teknik omdanner aktiviteten af en specifik ion opløst i en opløsning til et elektrisk potentiale, som kan måles ved et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbar væske (organisk, lipofil) fase med ionbyttende egenskaber. Ionoforen selektivt komplekser (bindingssted) specifikke ioner reversibelt og overfører dem mellem den vandige opløsning indeholdt i mikroelektrode (elektrolyt), og den vandige opløsning, hvori mikroelektrode er nedsænket (figur 1D). Denne ionoverførsel fører til en elektrokemisk ligevægt og en variation af den elektriske spænding mellem mikroelektroden og referenceelektroden måles af voltmeter. Spændingen er proportional med logaritmen til den specifikke ion aktivitet ifølge Nernst equation tillader beregning af ionkoncentrationen (figur 2A og B).
På nuværende tidspunkt tillader flere systemer måling af ion flux ved anvendelse af en lignende koncept eller princip. For eksempel Scanning Ion-selektive elektroder Technique (Siet) 12,13 eller mikroelektroden Ion Flux Estimation (MIFE) udviklet af Newman og Shabala 14-16 er kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendt af forskningsmiljøet for at bestemme specifik ion flusmidler forekommer på cellemembranen og væv på tværs af en bred vifte af dyr, planter og enkelt levende celle modeller. Ion-selektive mikroelektroder er blevet anvendt til at måle hydrogen, kalium og calcium flux hen planterødder 17, chlorid flux i rotte cerebrale arterier 18 og i pollen rør 19, brint flux i skate retinale celler 20, calcium flux i museknoglemarvs 21 forskellige ion flusmidler i svampehyfer 22 og i rved hornhinden 23, og endelig calciumflux under enkelt celle sårheling 12,24. Se også følgende anmeldelse af detaljerede oplysninger om ionselektive selvstændige henvisninger mikroelektroder 25.
Følgende artikel beskriver i detaljer, hvordan man forbereder og udfører måling af endogene ekstracellulære ionstrømme hjælp af ion-selektive selvrefererende mikroelektrode teknik på enkelt celle niveau.
De mest kritiske trin for en vellykket måling af ekstracellulære ionstrømme in vivo er: reduktion af støjen, den korrekte fremstilling af ionselektive mikroelektroder og referenceelektrode, og placeringen af prøven og begge elektroder.
For at minimere støj, bør registreringssystemet være i en jordet (jordforbundet) Faradays bur fortrinsvis med en metal-topped (vibrationsisolering) tabel, som også er jordforbundet. Desuden bør mikroskopet chassis også jordforbindes. Kilder…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |