आयन चयनात्मक स्व संदर्भित Microelectrode तकनीक का प्रयोग कोशिकी आयन अपशिष्टों का मापन
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
जानवरों, पौधों और एकल कक्षों से कोशिकाओं के बाहर से कोशिका द्रव्य है कि अलग कोशिका झिल्ली नामक एक बाधा से संलग्न हैं। ऐसे epithelia के रूप में सेल परतों को भी बाहर या बहुकोशिकीय जीव के विभिन्न डिब्बों से अंदर अलग करती है कि एक बाधा के रूप में। इन बाधाओं की एक प्रमुख विशेषता कोशिका झिल्ली या सेल परतों में आयनों के अंतर वितरण है। दो गुण इस वितरण की अनुमति: 1) झिल्ली और epithelia विशिष्ट आयनों को चयनात्मक पारगम्यता प्रदर्शित; 2) आयनों कोशिका झिल्ली और सेल परतों में पंप के माध्यम से ले जाया जाता है। इन गुणों के ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और मरम्मत के दौरान, क्षति के बाद संकेतों के संकेत के रूप में कार्य, या रोग की स्थिति के अंतर्गत। आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode ऐसे एकल कोशिका और ऊतक स्तरों पर कैल्शियम, पोटेशियम या सोडियम के रूप में आयनों की विशिष्ट अपशिष्टों के मापन के लिए अनुमति देता है। microelectrode है जो एक ionophore कॉकटेल होता हैएक विशिष्ट आयन करने के लिए चुनिंदा पारगम्य। आंतरिक भरने समाधान हित के आयन का एक सेट एकाग्रता है। microelectrode के बिजली के संभावित आयन के बाहर एकाग्रता से निर्धारित होता है। आयन एकाग्रता भिन्न होता है के रूप में, microelectrode के संभावित आयन की गतिविधि के प्रवेश के एक समारोह के रूप में बदल जाता है। (कारण आयन प्रवाह करने के लिए एक एकाग्रता ढाल में आईई) के आगे और पीछे आयन का एक स्रोत या सिंक के पास ले जाया गया, जब microelectrode के संभावित आयन प्रवाह / ढाल करने के लिए आनुपातिक एक आयाम में उतार चढ़ाव होता रहता। एम्पलीफायर microelectrode के संकेत amplifies और उत्पादन कंप्यूटर पर दर्ज की गई है। आयन प्रवाह तो ऐसे विशिष्ट आयन गतिशीलता के रूप में इलेक्ट्रोड संभावित उतार-चढ़ाव, microelectrode के भ्रमण, और अन्य मापदंडों का उपयोग प्रसार के Fick का कानून द्वारा गणना की जा सकती है। इस पत्र में, हम आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode एक का उपयोग कर कोशिकी आयन अपशिष्टों को मापने के लिए कार्यप्रणाली विस्तार से वर्णनकुछ प्रतिनिधि परिणाम पेश चाहते हैं।
Introduction
सभी पशु कोशिकाओं के बाहर के वातावरण से कोशिका द्रव्य अलग करती है जो एक लिपिड bilayer झिल्ली से घिरे हैं। सेल आयनों 1 के सक्रिय परिवहन के द्वारा, अंदर एक बिजली झिल्ली क्षमता, नकारात्मक रखता है। झिल्ली क्षमता कोशिका झिल्ली 2 में विभिन्न आणविक उपकरणों संचालित करने के लिए उपयोग कर सकते हैं जो एक संग्रहित ऊर्जा स्रोत है। न्यूरॉन्स और अन्य उत्तेजनीय कोशिकाओं बड़े झिल्ली क्षमता है। सोडियम चैनल की रैपिड उद्घाटन झिल्ली क्षमता (विध्रुवण) गिर और न्यूरॉन 2 की लंबाई के साथ ले जाया जाता है, जो संभावित कार्रवाई पैदा करता है। एक तरफ इन तेजी से बिजली के परिवर्तन से, कई ऊतकों और अंगों पैदा करते हैं और महत्वपूर्ण दीर्घकालिक बिजली क्षमता बनाए रखने के लिए। उदाहरण के लिए, त्वचा और कॉर्निया epithelia पैदा करते हैं और आयनों की दिशात्मक पंप (मुख्य रूप से सोडियम और क्लोराइड) 3 से पार उपकला क्षमता और बाह्य बिजली की धाराओं बनाए रखें।
अंतर्जात कोशिकी विद्युत प्रवाह की माप हिल जांच 4-6 और कोशिका झिल्ली और उपकला कोशिका परतों के बिजली के मानकों की माप की अनुमति microelectrode प्रणाली 7-10 का उपयोग कर झिल्ली या पार उपकला क्षमता के माप का उपयोग करते समय तम्बू ">, वे कोई दे शामिल आयन प्रजातियों का संकेत है।चयनात्मक ionophore साथ microelectrodes समाधान में विशिष्ट आयन एकाग्रता उपाय कर सकते हैं। आयन ढ़ाल या प्रवाह विभिन्न पदों पर दो या दो से अधिक इलेक्ट्रोड से मापा जा सकता है। हालांकि, हर जांच के आंतरिक वोल्टेज बहाव, अलग होना गलत माप या मौजूद नहीं था कि एक ढाल का भी पता लगाने के कारण होता है। यह दो बिंदुओं के बीच कम आवृत्ति पर चलता रहता है जिससे "आत्म संदर्भित" मोड में इस्तेमाल एक एकल इलेक्ट्रोड इस समस्या को हल करती है। अब आयन प्रवाह एक अपेक्षाकृत धीमी और स्थिर संकेत बहाव की पृष्ठभूमि के खिलाफ देखा जा सकता है (3B चित्रा देखें)। </p>
आयन के प्रति संवेदनशील माप प्रणाली के ऊतकों या एकल कक्षों के करीब आयनों के छोटे कोशिकी अपशिष्टों का पता लगाने के आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrodes का उपयोग करता है। प्रणाली microelectrode की गति को नियंत्रित करने के लिए microelectrode और एक माइक्रो stepper मोटर और ड्राइवर से संकेत प्रक्रियाओं जो एक एम्पलीफायर के होते हैं। सर्किट कि करीब आयन चयनात्मक microelectrode और संदर्भ इलेक्ट्रोड एक headstage के पूर्व एम्पलीफायर (चित्रा 1 ए) के माध्यम से एम्पलीफायर से जुड़े हैं। कम्प्यूटर सॉफ्टवेयर microelectrode के आंदोलन (आवृत्ति, दूरी) के मापदंडों का निर्धारण करता है और यह भी एम्पलीफायर के उत्पादन रिकॉर्ड करता है। stepper मोटर एक तीन आयामी micropositioner के माध्यम से microelectrode के आंदोलन को नियंत्रित करता है। आयन चयनात्मक microelectrode हिल एक कम आवृत्ति पहले विशिष्ट कैल्शियम प्रवाह 11 को मापने के लिए 1990 में विकसित किया गया था। के रूप में अच्छी तरह से कैल्शियम के रूप में, व्यावसायिक रूप से सुलभ ionophore कॉकटेल अब माइकर बनाने के लिए उपलब्ध हैंoelectrodes सोडियम, क्लोराइड, पोटेशियम, हाइड्रोजन, मैग्नीशियम, नाइट्रेट, अमोनियम, फ्लोराइड, लिथियम या पारा के प्रति संवेदनशील।
असल में, स्वयं को संदर्भित आयन चयनात्मक microelectrode तकनीक एक वोल्टमीटर से मापा जा सकता है, जो एक बिजली क्षमता में एक समाधान में भंग एक विशिष्ट आयन की गतिविधि धर्मान्तरित। ionophore कॉकटेल एक अमिश्रणीय तरल आयन एक्सचेंज गुणों के साथ (जैविक, lipophilic) चरण है। ionophore चुनिंदा (बांध) विशिष्ट आयनों reversibly और microelectrode (इलेक्ट्रोलाइट) में निहित जलीय घोल और microelectrode डूब जाता है, जिसमें जलीय घोल (चित्रा -1) के बीच स्थानान्तरण उन्हें परिसरों। इस आयन हस्तांतरण एक विद्युत संतुलन की ओर जाता है और microelectrode और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच बिजली की क्षमता का एक भिन्नता वोल्टमीटर से मापा जाता है। वोल्टेज नेर्न्स्ट ई के अनुसार विशिष्ट आयन की गतिविधि के लघुगणक के लिए आनुपातिक हैआयन एकाग्रता (2A चित्रा और बी) की गणना की इजाजत दी quation।
वर्तमान में, कई प्रणालियों एक इसी तरह की अवधारणा या सिद्धांत का उपयोग कर आयन प्रवाह की माप अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, न्यूमैन और Shabala 14-16 द्वारा विकसित की स्कैनिंग आयन चयनात्मक इलेक्ट्रोड तकनीक (एस आई इ टी) 12,13 या Microelectrode आयन फ्लक्स आकलन (MIFE) तकनीक का व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और व्यापक रूप से विशिष्ट आयन निर्धारित करने के लिए अनुसंधान समुदाय द्वारा किया जाता है पशु, पौधे और एक जीवित कोशिका मॉडल की एक किस्म भर में कोशिका झिल्ली और ऊतकों में होने वाली फलाक्सेस। आयन चयनात्मक microelectrodes के मस्तिष्क धमनियों चूहे में 18 और पराग ट्यूबों 19, स्केट रेटिना की कोशिकाओं 20 में हाइड्रोजन प्रवाह, माउस हड्डी 21, विभिन्न आयन में कैल्शियम प्रवाह में हाइड्रोजन, पोटेशियम और कैल्शियम प्रवाह पौधे की जड़ों 17 के पार, क्लोराइड प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है फंगल hyphae 22 में और अनुसंधान में अपशिष्टोंएकल कक्ष घाव के दौरान कॉर्निया 23, और अंत में कैल्शियम प्रवाह पर 12,24 चिकित्सा। यह भी आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrodes 25 के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए निम्न समीक्षा देखें।
निम्न आलेख तैयार करने और एकल कोशिका के स्तर पर आयन चयनात्मक स्वयं को संदर्भित microelectrode तकनीक का उपयोग कर अंतर्जात कोशिकी आयन अपशिष्टों की माप प्रदर्शन करने के लिए विस्तार से वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
vivo में बाह्य आयन अपशिष्टों के सफल माप के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: शोर में कमी, आयन चयनात्मक microelectrodes और संदर्भ इलेक्ट्रोड का सही निर्माण, और नमूना और दोनों इलेक्ट्रोड की स्थिति।
शोर को कम …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
Riferimenti
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