Måling av Ekstracellulær Ion Flukser Bruke Ion-selektive selvreferanser microelectrode Technique

Summary

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Abstract

Celler fra dyr, planter og enkeltceller er omsluttet av en barriere som kalles cellemembran som skiller cytoplasma fra utsiden. Cellelag slik som epitel danner også en barriere som skiller det indre utenfra eller forskjellige avdelinger av flercellede organismer. Et viktig trekk ved disse barrierene er differensial fordeling av ioner over cellemembranen eller cellelagene. To eiendommer tillate denne fordelingen: 1) membraner og epithelia vise selektiv permeabilitet til spesifikke ioner; 2) ioner transporteres gjennom pumpene over cellemembranen og cellelagene. Disse egenskapene spille viktige roller i å opprettholde vev fysiologi og fungere som signaliserte signaler etter skade, under reparasjonen, eller under patologisk tilstand. Den ion-selektive selvreferanse microelectrode tillater målinger av spesifikke flukser av ioner slik som kalsium, kalium eller natrium ved enkeltcelle og vevsnivåer. Den microelectrode inneholder en ionofor cocktail som erselektivt gjennomtrengelig for et bestemt ion. Den indre fyllingsoppløsning inneholder et sett konsentrasjon av det ion av interesse. Det elektriske potensial til mikroelektroden bestemmes av utsiden konsentrasjonen av ionet. Som ione-konsentrasjonen varierer, potensialet i microelectrode forandrer seg som en funksjon av logaritmen av ioneaktivitet. Når den beveges frem og tilbake i nærheten av en kilde eller vask av det ion (dvs. i en konsentrasjonsgradient på grunn ionefluks) mikroelektroden potensialet svinger ved en amplitude som er proporsjonal med ionefluks / gradient. Forsterkeren forsterker microelectrode signalet og utgangssignalet er innspilt på maskinen. Den ionefluks kan da beregnes ved Ficks diffusjonslov ved hjelp av elektrodepotensialet svingning, ekskursjon til mikroelektroden, og andre parametere som for eksempel det spesifikke ion mobilitet. I denne artikkelen beskriver vi i detalj metodikken for å måle ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode end presentere noen representative resultater.

Introduction

Alle dyreceller er omgitt av et lipidbilag membran som separerer cytoplasma fra omgivelsene utenfor. Cellen opprettholder et elektrisk membranpotensiale, negative innsiden, ved aktiv transport av ioner ^1. Membranen er en potensiell energikilde som er lagret i cellen kan bruke til å drive ulike molekylære enheter i membranen ^2. Nevroner og andre hissige celler har store membranpotensialer. Hurtig åpning av natriumkanaler kollapser membranpotensialet (depolarisering) og produserer virkningspotensialet som transporteres langs lengden av neuron ^2. Bortsett fra disse raske elektriske forandringer, mange vev og organer generere og opprettholde betydelige langsiktige elektriske potensialer. For eksempel, hud og hornhinnen epitel generere og vedlikeholde trans-epitelceller potensialer og ekstracellulære elektrisk strøm ved retnings pumping av ioner (hovedsakelig natrium og klorid) ^3.

telt "> Mens målinger av endogene ekstracellulære elektrisk strøm ved hjelp av den vibrerende sonde ^4-6 og målinger av membran eller trans-epitel potensialer ved hjelp av microelectrode systemet ^7-10 tillater måling av de elektriske parametre av cellemembraner og epiteliale cellelag, gir de ingen angivelse av de ion-artene som er involvert.

Mikroelektroder med selektiv ionofor kan måle spesifikke ion-konsentrasjonen i oppløsningen. Ion-gradienter eller flussmiddel kunne måles med to eller flere elektroder i forskjellige posisjoner. Imidlertid vil den iboende spenningen drift av hver sonde være forskjellig, noe som fører til unøyaktige målinger eller til påvisning av en gradient som ikke var til stede. En enkelt elektrode som brukes i "selvreferer" -modus hvor den beveger seg med lav frekvens mellom to punkter løser dette problemet. Nå er ionefluks kan sees på bakgrunn av en forholdsvis langsom og stabilt signal drift (se figur 3B). </p>

Den ion-sensitive målesystemet bruker ion-selektive selvreferanser mikroelektroder å oppdage små ekstracellulære fluks av ioner nær vev eller enkeltceller. Systemet består av en forsterker som behandler signalet fra mikroelektrode, og en mikro-stepper motor og driver for å styre bevegelsen til mikroelektroden. Den ion-selektive mikroelektroden og referanseelektroden som lukker kretsen er koblet til forsterkeren via en heads pre-forsterker (figur 1A). Datamaskinprogrammet bestemmer parametrene til mikroelektroden bevegelse (frekvens, avstand) og registrerer også utgangen fra forsterkeren. Trinnmotoren styrer microelectrode bevegelsen via en tredimensjonal micropositioner. En lavfrekvent vibrasjons ioneselektiv microelectrode ble først utviklet i 1990 for å måle spesifikk kalsiumflukssignal ^11. Samt kalsium, kommersielt tilgjengelige ionofor cocktailer er nå tilgjengelig for å gjøre microelectrodes følsom for natrium, klorid, kalium, hydrogen, magnesium, nitrat, ammonium, fluorid, litium eller kvikksølv.

I utgangspunktet, omdanner selvreferanse ioneselektiv microelectrode teknikk aktiviteten til et bestemt ion oppløst i en løsning i et elektrisk potensial, noe som kan måles ved hjelp av et voltmeter. Ionoforen cocktail er en ikke-blandbare væsker (organisk, lipofile) fase med ion-exchange egenskaper. Ionoforen selektivt komplekser (binder) spesifikke ioner reversibelt og overfører dem mellom den vandige oppløsning inneholdt i mikroelektrode (elektrolytt) og den vandige oppløsning hvori mikroelektroden er neddykket (figur 1D). Dette ion overføring fører til en elektrokjemisk likevekt og en variant av det elektriske potensial mellom mikroelektroden og referanseelektroden måles av voltmeteret. Spenningen er proporsjonal med logaritmen av den spesifikke ion aktivitet i henhold til Nernst equation tillater beregning av ione-konsentrasjonen (figur 2A og B).

I dag flere systemer tillater måling av ionefluks ved hjelp av et lignende konsept og prinsipp. For eksempel skanne Ion-selektive elektrode Technique (siet) ^12,13 eller microelectrode Ion Flux Estimering (mife) teknikk utviklet av Newman og Shabala ^14-16 er kommersielt tilgjengelig og mye brukt av forskersamfunnet for å kunne fastslå bestemt ion belegg skjer på cellemembranen og vev på tvers av en rekke dyr, planter og enkelt levende cellemodeller. Ion-selektive mikroelektroder er blitt brukt til å måle hydrogen, kalium og kalsium-fluks på tvers av planterøttene ^17, klorid flussmiddel i rottehjernearteriene ¹⁸ og i pollen rør ^19, hydrogen fluks i skatenetthinneceller ^20, kalsium fluks i mus ben ^21, en ​​rekke Ion flukser i soppens hyfer ²² og i rpå hornhinnen ^23, og til slutt kalsium flux under enkelt celle sårtilheling ^12,24. Se også følgende vurdering for detaljert informasjon om ion-selektive selvreferanser mikroelektroder ^25.

Den følgende artikkelen beskriver i detalj hvordan du kan forberede og utføre måling av endogene ekstracellulære ion flukser bruker ion-selektive selvreferanse microelectrode teknikk på celle-nivå.

Protocol

1. Ion-selektive selvreferanser microelectrode Forberedelse Utarbeidelse av ioneselektiv microelectrode Varme trekke tynnveggede kapillærer borsilikat uten filament (1,5 mm ytre diameter, 1,12 mm indre diameter) med en mikroelektrode avtrekker. Merk: Dette gir tips 3-4 mikrometer i diameter. Mindre spissene har høyere motstand som gjør mikroelektroder mer utsatt for elektronisk støy, og er også forbundet med en langsommere respons til en endring i ionekonsentrasjon. Nyttig informasjon fin…

Representative Results

Vi har tidligere vist at kalsium tilstrømningen vises etter enkelt celle såret 24. Vi ba derfor om andre ion fluks oppstå ved enkelt celle såret. Vi brukte X. laevis eggcelle, en veletablert modell for enkelt celle sårtilheling 30-34 og elektrofysiologisk registrering 24,35-39. Interessant, kalium ioner er mer konsentrert inne X. laevis oocytter (ca. 110 mm) 40 enn i det ekstracellulære oppløsning som anvendes (i MMR 1x: 1 mM), og antyder en utstrømni…

Discussion

De mest kritiske trinn for vellykket måling av ekstracellulære ion flukser in vivo er: reduksjon av støy, er den riktige fremstillingen av ion-selektive mikroelektroder og referanseelektrode, og posisjoneringen av prøven og begge elektroder.

For å minimalisere støy, bør registreringssystemet være i en jordet (jordet) Faraday-bur, fortrinnsvis med et metall-toppet (vibrasjonsisolasjon) tabell som også er jordet. I tillegg bør mikroskopet understellet også være jordet. Kil…

Materials

IonAmp	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner	World Precision Instruments	Model KITE-R	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand	World Precision Instruments	Model M10	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table	Newport Inc.	Model VW-3036-OPT-023040	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces	Newport Inc.	Model 360-90	Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel	Newport Inc.	460PD-X	none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament	World Precision Instruments	TW150-4	none
Electrode puller	Narishige	PC-10	none
Metal rack	Made in-house	none	Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven	QL	Model 10 Lab Oven	none
Silanization solution I	Sigma-Aldrich	85126	Hazardous, handle as recommended by provider
Glass Petri dish; Pyrex	Fisher Scientific	316060	none
Electrode/micropipette storage jar	World Precision Instruments	E215	none
Glass dessicator	Fisher Scientific	08-595E	Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette	Fisher Scientific	11597722	none
Bunsen burner	Fisher Scientific	S97329	none
Microscope slide	Sigma-Aldrich	S8902	none
Straight microelectrode holder	Warner Instruments	QSW-A15P	with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder	World Precision Instruments	MEH3S	with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector
6 cm Petri dish	VWR	60872-306	none
Nitex mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	none
Glue; Loctite epoxy	VWR	500043-451	Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water	Sigma-Aldrich	99053	none
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	none
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	none
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	none
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266	none
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	none
Sodium Hydroxyde	Sigma-Aldrich	S8045	none
Potassium Acetate	Sigma-Aldrich	P1190	none
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	none