Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
As células de animais, plantas e células individuais são envolvidas por uma barreira chamada a membrana celular que separa o citoplasma a partir do exterior. Camadas de células, tais como os epitélios também formam uma barreira que separa o interior a partir do exterior ou diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Uma característica chave destas barreiras é a distribuição diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas de células. Duas propriedades permitem que esta distribuição: 1) membranas e epitélios exibir permeabilidade seletiva de íons específicos; 2) são transportados através de bombas de iões através das membranas celulares e camadas de células. Estas propriedades desempenham um papel crucial na manutenção da fisiologia do tecido e agir como sinalização sinais de avaria, durante o reparo, ou sob condição patológica. A auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões permite medições de fluxos de iões específicos, tais como cálcio, potássio ou sódio em níveis de células e tecidos individuais. O microeléctrodo contém um ionóforo que é cocktailselectivamente permeável a um ião específico. A solução de enchimento interno contém um conjunto de concentração do íon de interesse. O potencial eléctrico do microeléctrodo é determinada pela concentração do ião exterior. À medida que a concentração de ião varia, o potencial do microeléctrodo muda como uma função do log da actividade de iões. Quando mudou-se para trás e perto de uma fonte ou sumidouro de íon (ou seja, em um gradiente de concentração devido ao fluxo de iões) o potencial flutua microeletrodos a uma amplitude proporcional ao fluxo de iões / gradiente. O amplificador amplifica o sinal de microeléctrodos e a produção é registada no computador. O fluxo de iões pode então ser calculado pela lei de Fick da difusão utilizando a flutuação potencial de eléctrodo, a excursão de microeléctrodo, e outros parâmetros, tais como a mobilidade de iões específica. Neste artigo, descreve em detalhes a metodologia para medir fluxos de iões extracelulares utilizando a auto-referência de microeletrodos um íon-seletivod apresentar alguns resultados representativos.
Introduction
Todas as células animais estão rodeados por uma membrana de bicamada lipídica que separa o citoplasma a partir do ambiente exterior. A célula mantém um potencial de membrana elétrica, negativa no interior, por transporte ativo de íons um. O potencial de membrana é uma fonte de energia que a célula pode utilizar para operar vários dispositivos moleculares na membrana 2. Neurônios e outras células excitáveis têm grandes potenciais de membrana. Rápida abertura dos canais de sódio recolhe o potencial de membrana (despolarização) e produz o potencial de acção que é transportado ao longo do comprimento do neurónio 2. Aparte destas alterações eléctricos rápidos, muitos tecidos e órgãos gerar e manter potenciais eléctricos significativos a longo prazo. Por exemplo, a pele e os epitélios da córnea gerar e manter potenciais trans-epiteliais e correntes eléctricas extracelulares por bombagem de iões direccional (principalmente cloreto de sódio e) 3.
tenda "> Enquanto as medições de corrente eléctrica extracelular endógena utilizando a sonda de vibração 4-6 e medições de membrana ou trans-epitelial potenciais utilizando o sistema de microeléctrodos 7-10 permitem a medição dos parâmetros eléctricos de membranas celulares e camadas de células epiteliais, eles não dão indicação da espécie iónicos envolvidos.Microeletrodos com ionóforo seletivo pode medir a concentração de íon específico em solução. Gradientes de iões ou de fluxo podia ser medido com dois ou mais eléctrodos em diferentes posições. No entanto, o desvio de tensão intrínseco de cada sonda seria diferente, fazendo medições imprecisas ou mesmo a detecção de um gradiente que não estava presente. Um único eletrodo usado em modo "auto-referência", pelo qual ele se move em baixa frequência entre dois pontos resolve este problema. Agora o fluxo de iões pode ser visto no contexto de um relativamente lento e estável desvio de sinal (veja a Figura 3B). </p>
O sistema de medição sensível-ion utiliza microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo para detectar pequenos fluxos extracelulares de íons perto de tecidos ou células individuais. O sistema é composto por um amplificador que processa o sinal a partir do microeléctrodos e um motor passo a passo e micro controlador para controlar o movimento do microeléctrodo. O microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência que fecha o circuito está ligado ao amplificador de andar de entrada por meio de um pré-amplificador (Figura 1A). O software de computador determina os parâmetros do movimento de microeléctrodos (frequência, distância) e também regista a saída do amplificador. O motor de passo controla o movimento através de um microeléctrodo microposicionador tridimensional. A baixa freqüência de vibração de microeletrodos íon-seletivo foi desenvolvido pela primeira vez em 1990 para medir o fluxo de cálcio específica 11. Bem como cálcio, cocktails ionóforos comercialmente acessíveis estão agora disponíveis para fazer microelectrodes sensíveis ao sódio, cloreto, potássio, hidrogénio, magnésio, nitrato, amónio, fluoreto, lítio ou mercúrio.
Basicamente, o ião-selectivo técnica de microeléctrodo auto-referenciar converte a actividade de um ião específico dissolvido numa solução para um potencial eléctrico, que pode ser medida por um voltímetro. O coquetel de ionóforo é um líquido imiscível (lipofílico orgânico,) fase com propriedades de permuta iónica. O ionóforo de complexos (se liga selectivamente iões específicos reversivelmente) e transfere-os entre a solução aquosa contida no microeléctrodo (electrólito) e a solução aquosa em que o microeléctrodo é imerso (Figura 1D). Esta transferência de iões leva a um equilíbrio electroquímica e uma variação do potencial eléctrico entre os microeléctrodos e o eléctrodo de referência é medido pelo voltímetro. A tensão é proporcional ao logaritmo da actividade específica de iões de acordo com a Nernst equation permitindo o cálculo da concentração de iões (Figura 2A e B).
Actualmente, vários sistemas de permitir a medição do fluxo de iões utilizando um conceito ou princípio semelhante. Por exemplo, a técnica do eletrodo íon-seletivo Scanning (SIET) 12,13 ou o microeletrodos Ion Flux Estimação (MIFE) técnica desenvolvida por Newman e Shabala 14-16 estão comercialmente disponíveis e amplamente utilizado pela comunidade de investigação a fim de determinar íon específico fundentes ocorrendo a membrana da célula e do tecido através de uma variedade de animais, plantas e modelos de células de estar solteiro. Microeletrodos íon-seletivo têm sido usados para medir hidrogênio, potássio e fluxo de cálcio através de raízes de plantas 17, cloreto de fluxo em artérias cerebrais de ratos 18 e em tubos polínicos 19, fluxo de hidrogênio em células da retina de skate 20, o fluxo de cálcio no osso do rato 21, vário íon fluxos em 22 de hifas fúngicas e no ra córnea 23, e, finalmente, o fluxo de cálcio durante a cura da ferida célula única 12,24. Veja também a seguinte análise para obter informações detalhadas sobre auto-referência microeletrodos íon-seletivo 25.
O artigo a seguir descreve em detalhes como preparar e realizar a medição de fluxos de iões extracelulares endógenos utilizando a auto-referência técnica microeletrodos íon-seletivo no nível da célula única.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos para a medição de fluxos de iões bem sucedida extracelulares in vivo são os seguintes: a redução do ruído, o fabrico correcto do micro-eléctrodos selectivos de iões e do eléctrodo de referência, e o posicionamento da amostra e ambos os eléctrodos.
A fim de minimizar o ruído, o sistema de gravação deve estar em uma ligação à terra (aterrada) gaiola de Faraday de preferência com um (isolamento de vibração) mesa com tampo de metal que tamb?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
Riferimenti
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