JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Published: May 03, 2015
doi:
10.3791/52782
, , , ,
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures,University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental,Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience,University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures,University of California, Davis

Summary

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Abstract

Клетки животных, растений и отдельных клеток заключены в барьере называемой клеточной мембраны, которая отделяет цитоплазму извне. Слои клеток, таких как эпителий и формируют барьер, который отделяет внутреннюю снаружи или различных отсеках многоклеточных организмов. Ключевой особенностью этих барьеров дифференциальное распределение ионов через клеточные мембраны или слоев клеток. Два свойства позволяют этого распределения: 1) мембраны и эпителия отображения избирательную проницаемость для ионов конкретных; 2) ионы транспортируются через насосы через клеточные мембраны и клеточных слоев. Эти свойства играют решающую роль в поддержании тканей физиологии и выступать в качестве реплики сигнализации после повреждения, во время ремонта или при патологическом состоянии. Ионоселективный автореферентное микроэлектрода позволяет измерять конкретных потоков ионов, таких как кальций, калий или натрий в отдельных уровнях клеток и тканей. Микроэлектрод содержит ионофор коктейль, который являетсяселективно проницаемой для конкретного иона. Внутреннее решение наполнения содержит набор концентрацию иона интереса. Электрический потенциал микроэлектрода определяется внешним концентрации иона. Как концентрация ионов изменяется, потенциал микроэлектрода изменяется в зависимости от логарифма активности ионов. При перемещении вперед и назад, рядом с источником или стоком иона (т.е. в градиента концентрации из-за потока ионов) микроэлектрод потенциал колеблется с амплитудой, пропорциональной потока ионов / градиента. Усилитель усиливает сигнал микроэлектрода, а выход записывается на компьютере. Поток ионов может быть рассчитана по закону диффузии Фика с использованием электродного потенциала колебание, экскурсии из микроэлектрода, а также других параметров, таких как конкретное подвижности ионов. В этой статье мы подробно описать методологию для измерения потоков ионов внеклеточного помощью ионно-селективный автореферентных микроэлектродного апD Приведем некоторые репрезентативные результаты.

Introduction

Все животные клетки окружены липидный бислой мембраны, которая отделяет цитоплазму от внешней среды. Клетка сохраняет электрический мембранный потенциал, негативно внутри, активным транспортом ионов 1. Мембранный потенциал источник скрытой энергии, которое клетка может использовать для работы различные молекулярные устройства в мембране 2. Нейроны и другие возбудимые клетки имеют большие мембранных потенциалов. Быстрое открытие натриевых каналов падает мембранный потенциал (деполяризации) и производит потенциал действия, который транспортируется по всей длине нейрона 2. Помимо этих быстрых электрических изменений, многие ткани и органы генерировать и поддерживать значительные долгосрочные электрических потенциалов. Например, кожа и эпителии роговицы генерировать и поддерживать транс-эпителиальные потенциалы и внеклеточные электрические токи, направленным накачки ионов (в основном натрия и хлорида) 3.

палатка "> В то время как измерения эндогенного внеклеточного электрического тока с помощью вибрирующего зонда 4-6 и измерения мембранных или транс-эпителиальных потенциалов с помощью системы микроэлектродного 7-10 позволяют измерение электрических параметров клеточных мембран и эпителиальных клеточных слоев, они дают нет указание вида ионов, участвующих.

Микроэлектроды с селективным ионофора можно измерить конкретный концентрации ионов в растворе. Ионные градиенты или поток может быть измерена с двумя или более электродами в различных положениях. Тем не менее, внутренняя напряжение дрейфа каждого зонда будет отличаться, в результате чего точность измерений или даже обнаружение градиентом, который не присутствовал. Один электрод используется в режиме "автореферентных", когда он движется на низкой частоте между двумя точками решает эту проблему. Теперь поток ионов можно увидеть на фоне относительно медленного и стабильного сигнала дрейфа (рис 3B). </р>

Измерительная система ионно-чувствительный использует ион-селективные автореферентных микроэлектродов для обнаружения малых внеклеточные потоки ионов, близких к ткани или отдельные клетки. Система состоит из усилителя, который обрабатывает сигнал от микроэлектрода и микро шаговый двигатель и водителю контролировать движение микроэлектрода. Ионоселективный микроэлектрода и электрод сравнения, что замкнуть цепь подключены к усилителю через headstage предварительного усилителя (фиг.1А). Компьютерное программное обеспечение определяет параметры движения микроэлектродов (частота, расстояние), а также записывает выход усилителя. Шаговый двигатель управляет движением микроэлектрода через трехмерного микроподвижки. Низкая частота вибрационный ион-селективный микроэлектрод была впервые разработана в 1990 году для измерения потока конкретной кальция 11. А также кальций, коммерчески доступные ионофорные коктейли теперь доступны, чтобы сделать MICRoelectrodes чувствительны к натрия, хлорид, калия, магния, водорода, нитрат, аммоний, фтористый литий, или ртуть.

В принципе, автореферентное ионно-селективной микроэлектрода преобразует активность конкретного иона растворенного в растворе в электрический потенциал, который может быть измерен с помощью вольтметра. Ионофор коктейль не смешивается жидкость (органические, липофильный) фаза с ионообменных свойств. Ионофор избирательно связывается комплексов () конкретных ионов обратимо и передает их между водного раствора, содержащегося в микроэлектродов (электролит) и водного раствора, в котором микроэлектрода погружен (фиг 1D). Это перенос ионов приводит к электрохимической равновесия и изменение электрического потенциала между микроэлектрода и электродом измеряется с помощью вольтметра. Напряжение пропорционально логарифму активности ионов конкретного согласно Нернста еquation позволяет рассчитывать концентрацию ионов (рис 2А и В).

В настоящее время, несколько систем позволяют измерять потока ионов с помощью подобную концепцию или принцип. Например, сканирование Ион-селективный электрод Техника (Siet) 12,13 или (MIFE) метод Микроэлектродные потока ионов Оценка развивается Ньюманом и Shabala 14-16 коммерчески доступны и широко используется в научном сообществе с целью определения конкретного ион флюсы происходящих на клеточной мембране и ткани в различных животных, растений и моделей отдельных живой клетки. Ионоселективные микроэлектродов были использованы для измерения водорода, калия и кальция поток через корни растений 17, поток хлорида в церебральных артерий крысы 18 и в пыльцевых трубок 19, поток водорода в коньках клеток сетчатки 20, поток кальция в кости мыши 21, различные ионов потоки в гиф гриба 22 и в Rна роговице 23 и, наконец, потока кальция во время одной раны клеток исцеления 12,24. Смотрите также следующую обзор для детальной информации о ионоселективных автореферентными микроэлектродов 25.

Следующая статья подробно описывает, как подготовить и выполнить измерения эндогенных внеклеточных потоков ионов с использованием ионно-селективный автореферентных технику микроэлектродного на одном уровне клетки.

Protocol

1. Ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Подготовка Приготовление ион-селективного микроэлектрода Тепло тянуть тонкостенных боросиликатного капилляров без нити (1,5 мм наружный диаметр, мм 1.12 Внутренний диаметр) с использованием микроэлектрода съемник. Прим…

Representative Results

Ранее мы уже показали, что приток кальция появляется после одной клетки ранив 24. Поэтому мы попросили, происходят ли другие потоки ионов на одной ранения клеток. Мы использовали X. Laevis яйцеклетки, устоявшуюся модель одной клетки заживления ран 30-34 и электрофизиологическ…

Discussion

Наиболее важные шаги для успешного измерения внеклеточного потоков ионов в естественных условиях являются: снижение шума, правильно выдумка ион-селективные микроэлектродов и электродом сравнения, и позиционирование образца и обоих электродов.

Для того чтобы мин?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

Materials

IonAmp   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32   BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA INA116 BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA none three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner   World Precision Instruments  Model KITE-R Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand    World Precision Instruments Model M10 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table   Newport Inc.      Model VW-3036-OPT-023040 Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces Newport Inc.      Model 360-90 Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel Newport Inc.      460PD-X none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel Newport Inc. 460A-XY none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament  World Precision Instruments  TW150-4 none
Electrode puller  Narishige  PC-10 none
Metal rack Made in-house none Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven QL Model 10 Lab Oven none
Silanization solution I  Sigma-Aldrich 85126 Hazardous, handle as recommended by provider 
Glass Petri dish; Pyrex Fisher Scientific 316060 none
Electrode/micropipette storage jar World Precision Instruments  E215 none
Glass dessicator Fisher Scientific 08-595E Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette  Fisher Scientific 11597722 none
Bunsen burner Fisher Scientific S97329 none
Microscope slide Sigma-Aldrich S8902 none
Straight microelectrode holder Warner Instruments QSW-A15P with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder  World Precision Instruments MEH3S with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector 
6 cm Petri dish VWR 60872-306 none
Nitex mesh Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX750 none
Glue; Loctite epoxy VWR 500043-451 Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water  Sigma-Aldrich 99053 none
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 none
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 none
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 none
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266 none
Hepes Sigma-Aldrich H3375 none
Sodium Hydroxyde Sigma-Aldrich S8045 none
Potassium Acetate Sigma-Aldrich P1190 none
Agarose Sigma-Aldrich A9539 none
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Tags

Ion-selective Self-referencing MicroelectrodeExtracellular Ion FluxIon TransportCell MembraneCell LayerIon GradientFick’s Law Of DiffusionIon Flux MeasurementCalciumPotassiumSodium
check_url/it/52782?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Luxardi, G., Reid, B., Ferreira, F., Maillard, P., Zhao, M. Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique. J. Vis. Exp. (99), e52782, doi:10.3791/52782 (2015).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image