Förfarande för att mäta aktiviteten hos Deubiquitinating Enzymer i cellinjer och vävnadsprover
Summary
Det nuvarande protokollet detaljer ett förfarande för att mäta aktiviteten av funktionellt homologt deubiquitinating enzymer. Specialiserade prober kovalent modifiera enzymet och möjliggöra upptäckt. Denna metod har potential att identifiera nya terapeutiska mål.
Abstract
Ubiquitin-proteasom-systemet har nyligen satts i samband med olika patologier, inklusive neurodegenerativa sjukdomar och cancer. I ljuset av detta, tekniker för att studera den reglerande mekanismen hos detta system är viktiga för att klargöra de cellulära och molekylära processer av ovan nämnda sjukdomar. Användningen av hemagglutinin härledd ubiquitin prober som beskrivs i detta dokument utgör ett värdefullt verktyg för att studera detta system. Denna uppsats detaljer en metod som gör det möjligt för användaren att utföra analyser som ger en direkt visualisering av deubiquitinating enzymaktivitet. Deubiquitinating enzymer styr proteasomal nedbrytning och dela funktionell homologi i sina aktiva säten, som gör det möjligt för användaren att undersöka aktiviteten av flera enzymer i en analys. Lysat erhålls genom försiktig mekanisk cellsönderdelning och inkuberades med aktiv sätesriktad prober. Funktionella enzymer taggade med sonderna medan inaktiva enzymer förblir obunden. Genom körningning denna analys erhåller användaren information om både aktivitet och potentiell expression av multipla deubiquitinating enzymer på ett snabbt och enkelt sätt. Den nuvarande metoden är betydligt effektivare än att använda individuella antikroppar för de förutsagda hundra deubiquitinating enzymer i den mänskliga cellen.
Introduction
Ubiquitin-proteasom-systemet (UPS) fungerar som en av de större nedbrytningsvägar i däggdjurscellen. Underlag väg till nedbrytning i proteasomen är kovalent märkta med polymerer av ubiquitin (UB) 1. Innan den riktade substratet in i proteasomen för nedbrytning, måste poly-ubiquitin tag tas bort. En klass av enzymer som kallas deubiquitinating enzymer (Dubs) är ansvarig för avlägsnande och återvinning av ubiquitin-molekyler 2. Det har förutsagts från det mänskliga genomet att det finns nästan hundra Dubs arbetar i cellen 3. Med ett så stort antal Dubs styr Ub-förmedlade cellulära processer, studera dessa enzymer är en utmaning eftersom mRNA tekniker inte ger information om verksamheten och western blotting bara ger information om uttrycksnivåer.
Användningen av influensa hemagglutinin (HA) tagged, Ub-härledda aktivt ställe riktad prober möjliggör en kovalent modförgasning av de funktionella DUBS och därför ger en direkt visualisering av aktiviteten av dessa enzymer på en western blöt 4. Probema har en C-terminal tiol reaktiv grupp som fungerar som ett självmordssubstrat för det aktiva stället cysteinresten 5. Med dessa sönder, är det möjligt att studera aktiviteten och potentiell expression av många dubbar under både patologiska och fysiologiska tillstånd i cellen.
Förändringar i DUB-aktivitet har implicerats i ett antal patologiska tillstånd såsom Parkinsons, Alzheimers, anemi och olika cancerformer 6-10. Denna teknik ger ett kraftfullt verktyg för att studera sjukdom. I föreliggande dokument visar vi tillämpningen av denna teknik i HeLa och M17-celler som har lyserats med hjälp av glaspärlor. Dessutom, vi beskriva hur man använder den här metoden i mus ryggmärgsvävnadsprover. Den information som erhålls från denna teknik kan användas som en utgångspunkt för att identifieraterapeutiska mål samt upprättande av modeller för att studera olika sjukdomstillstånd. Den sanna användbarheten av denna teknik ligger i dess förmåga att tillhandahålla information om flera dubbar i en enda analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom ubikitinering är en grundläggande cellulär aktivitet, kunde förstå regleringsmekanismer vara nyckeln till att avslöja processerna för sjukdomen och patologi. Användningen av HA märkt Ub-härledda aktiva sätesriktad prober som redovisas här är ett enkelt, men mycket användbar metod för att studera Ub-medierad proteinnedbrytning. Denna metod är snabbare och billigare än att studera var och en av de dubbar individuellt.
I denna metod är lys av cellerna uppnås genom me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Lee labb vid University of Minnesota för att ge ryggmärgen hos möss vävnadsprover som användes. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet äggstockscancer Research Program (OCRP) OC093424 till MB, av Randy Shaver cancerforskning och gemenskapens fond till MB och Minnesota äggstockscancer Alliance (MOCA) till MB. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Riferimenti
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
