Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

Summary

Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo. In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.

Abstract

Il fegato ha una grande capacità di rigenerarsi. Gli epatociti, le cellule parenchimali del fegato, può rigenerare in uno di due modi: rigenerazione epatica hepatocyte- o biliare-driven. In rigenerazione del fegato epatociti-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da epatociti preesistenti, mentre, nella rigenerazione biliare-driven, epatociti rigeneranti sono derivati ​​da cellule epiteliali biliari (BECS). Per la rigenerazione del fegato epatociti-driven, ci sono ottimi modelli di roditori che hanno significativamente contribuito alla attuale comprensione della rigenerazione epatica. Tuttavia, non esiste tale modello roditore per la rigenerazione epatica biliare-driven. Recentemente abbiamo riportato su un modello di danno epatico zebrafish in cui BEC ampiamente danno luogo a epatociti sul grave perdita degli epatociti. In questo modello, gli epatociti sono specificamente asportate da un mezzo di farmacogenetica. Qui vi presentiamo in dettaglio i metodi per l'ablazione epatociti e di analizzare il processo di rigenerazione epatica BEC-driven.Questo modello di ablazione specifici epatociti può essere ulteriormente utilizzato per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione epatica biliare-driven. Inoltre, questi metodi possono essere applicati agli schermi chimici per identificare piccole molecole che aumentano o sopprimono rigenerazione epatica.

Introduction

Il fegato è un organo altamente rigenerativa. Durante la rigenerazione del fegato, rigenerante epatociti, le cellule parenchimali del fegato, sono derivati ​​da epatociti preesistenti (rigenerazione del fegato epatociti-driven) o BEC (rigenerazione epatica biliare-driven) ^1,2. Danno epatico solito provoca la proliferazione di epatociti preesistenti; tuttavia, quando la proliferazione degli epatociti è compromessa, BEC può contribuire agli epatociti ^2-4. Queste due modalità di rigenerazione epatica sono clinicamente significativi. Dopo la rimozione chirurgica di una porzione di fegato umano (ad esempio, a causa di tumori epatici o donato....

Protocol

Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo procedura standard; Esperimenti sono stati approvati dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di embrioni / larve

1. Per condurre accoppiamenti a tempo, impostare adulti maschi e femmine Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^s931 pesci hemizygous o omozigoti O / N e inserire un divisore tra di loro. Rimuovere questo divisore il mattino seguente quando si desidera accoppiamento. Raccogliere gli embrioni da sforzare l'acqua con un colino a maglia fine di plastica.
2. Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la su....

Results

Trattamento Mtz per 36 ore (A36h, A sta per l'ablazione) 3,5-5 dpf ridotto drasticamente le dimensioni del fegato (Figura 1B). Dopo Mtz washout, considerato come l'inizio della rigenerazione epatica (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: espressione DsRed riapparso in 30 ore (Figura 1B). La rete biliare intraepatica, valutata mediante espressione di Alcam che è presente nella membrana di BECs ^22, inizialmente crollata ma fu ripristinata al 54 hr post-washout.......

Discussion

Grave, ma non mite, epatociti ablazione suscita rigenerazione epatica biliare-driven. Pertanto, dopo il trattamento Mtz e washout, è importante esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattato, che può essere valutata intrinseca CFP fluorescenza dal fabp10a: CFP-NTR transgene. Poiché una piccola percentuale di larve Mtz trattati visualizzerà non ablazione (0-5%) o parzialmente ablato (10-20%) fegati, è essenziale per risolvere e solo analizzare le larve con un piccolo fegato, che è indicativo di grav.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estere etilico (Tricaina) dell'acido benzoico 3-amminoico	in polvere Sigma-Aldrich	A5040	Fare lo 0,4% (15 mM) di tricaina : Portare 0,4 g di tricaina a 100 ml con acqua d'uovo. Regolare a pH 7.
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazolo	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldeide	Sigma-Aldrich	252549
Solfato di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	C3771
N-Feniltiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Supporti di montaggio (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm piastra di Petri	Denville Scientific Inc.	Smalto trasparente M5300
	Fisher Scientific	50949071
pinze fini	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
vetrino	Fisher Scientific	12-544-1
vetrino coprioggetti	Fisher Scientific	12-540-A e 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (topo anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 diluizione
capra anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 diluizione
ratto anti-RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 diluizione
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	Diluizione 1:500
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	Diluizione 1:500
Cy3 donkey anti-ratto IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 diluizione
microscopio Leica	Microsystems	S6F
microscopio a epifluorescenza	Leica Microsystems	M205FA
microscopio confocale	Carl Zeiss	LSM700
acqua d'uovo			0,3 g/L di sali marini ' Oceano istantaneo' e 0,5 mM CaSO4 in acqua distillata.
[intestazione]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7.  Autoclave per 20 min a 121°C.
1X PBSDT			0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO in 1 X PBS.
tampone			30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7.
Soluzione			Mescolare 1 ml di siero di cavallo inattivato termicamente con 9 ml di 1X PBSDT.