Per aiutare a valutare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione epatica guidata dalle vie biliari del pesce zebra, abbiamo stabilito un modello di danno epatico in cui gli epatociti che esprimono nitroreduttasi vengono geneticamente ablati dopo il trattamento con metronidazolo. In questo protocollo, descriviamo come manipolare, monitorare e analizzare abilmente l'ablazione degli epatociti e la rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari.
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Articolo metodologico
Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fegato ha una grande capacità di rigenerarsi. Gli epatociti, le cellule parenchimali del fegato, può rigenerare in uno di due modi: rigenerazione epatica hepatocyte- o biliare-driven. In rigenerazione del fegato epatociti-driven, epatociti rigeneranti sono derivati da epatociti preesistenti, mentre, nella rigenerazione biliare-driven, epatociti rigeneranti sono derivati da cellule epiteliali biliari (BECS). Per la rigenerazione del fegato epatociti-driven, ci sono ottimi modelli di roditori che hanno significativamente contribuito alla attuale comprensione della rigenerazione epatica. Tuttavia, non esiste tale modello roditore per la rigenerazione epatica biliare-driven. Recentemente abbiamo riportato su un modello di danno epatico zebrafish in cui BEC ampiamente danno luogo a epatociti sul grave perdita degli epatociti. In questo modello, gli epatociti sono specificamente asportate da un mezzo di farmacogenetica. Qui vi presentiamo in dettaglio i metodi per l'ablazione epatociti e di analizzare il processo di rigenerazione epatica BEC-driven.Questo modello di ablazione specifici epatociti può essere ulteriormente utilizzato per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione epatica biliare-driven. Inoltre, questi metodi possono essere applicati agli schermi chimici per identificare piccole molecole che aumentano o sopprimono rigenerazione epatica.
Introduzione
Il fegato è un organo altamente rigenerativa. Durante la rigenerazione del fegato, rigenerante epatociti, le cellule parenchimali del fegato, sono derivati da epatociti preesistenti (rigenerazione del fegato epatociti-driven) o BEC (rigenerazione epatica biliare-driven) 1,2. Danno epatico solito provoca la proliferazione di epatociti preesistenti; tuttavia, quando la proliferazione degli epatociti è compromessa, BEC può contribuire agli epatociti 2-4. Queste due modalità di rigenerazione epatica sono clinicamente significativi. Dopo la rimozione chirurgica di una porzione di fegato umano (ad esempio, a causa di tumori epatici o donato....
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Protocollo
Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo procedura standard; Esperimenti sono stati approvati dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione di embrioni / larve
- Per condurre accoppiamenti a tempo, impostare adulti maschi e femmine Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 pesci hemizygous o omozigoti O / N e inserire un divisore tra di loro. Rimuovere questo divisore il mattino seguente quando si desidera accoppiamento. Raccogliere gli embrioni da sforzare l'acqua con un colino a maglia fine di plastica.
- Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la su....
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Risultati
Trattamento Mtz per 36 ore (A36h, A sta per l'ablazione) 3,5-5 dpf ridotto drasticamente le dimensioni del fegato (Figura 1B). Dopo Mtz washout, considerato come l'inizio della rigenerazione epatica (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: espressione DsRed riapparso in 30 ore (Figura 1B). La rete biliare intraepatica, valutata mediante espressione di Alcam che è presente nella membrana di BECs 22, inizialmente crollata ma fu ripristinata al 54 hr post.......
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Discussione
Grave, ma non mite, epatociti ablazione suscita rigenerazione epatica biliare-driven. Pertanto, dopo il trattamento Mtz e washout, è importante esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattato, che può essere valutata intrinseca CFP fluorescenza dal fabp10a: CFP-NTR transgene. Poiché una piccola percentuale di larve Mtz trattati visualizzerà non ablazione (0-5%) o parzialmente ablato (10-20%) fegati, è essenziale per risolvere e solo analizzare le larve con un piccolo fegato, che è indicativo di grav.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i dottori Hukriede e Tsang per le discussioni. M.K. è stato sostenuto da una borsa di formazione NIH (T32EB001026). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'American Liver Foundation, della March of Dimes Foundation (5-FY12-39) e del NIH (DK101426) a D.S.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Estere etilico (Tricaina) dell'acido benzoico 3-amminoico | in polvere Sigma-Aldrich | A5040 | Fare lo 0,4% (15 mM) di tricaina : Portare 0,4 g di tricaina a 100 ml con acqua d'uovo. Regolare a pH 7. |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazolo | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Solfato di calcio diidrato | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Supporti di montaggio (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm piastra di Petri | Denville Scientific Inc. | Smalto trasparente M5300 | |
| Fisher Scientific | 50949071 | ||
| pinze fini | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| vetrino | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| vetrino coprioggetti | Fisher Scientific | 12-540-A e 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (topo anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 diluizione |
| capra anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 diluizione |
| ratto anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 diluizione |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | Diluizione 1:500 |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | Diluizione 1:500 |
| Cy3 donkey anti-ratto IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 diluizione |
| microscopio Leica | Microsystems | S6F | |
| microscopio a epifluorescenza | Leica Microsystems | M205FA | |
| microscopio confocale | Carl Zeiss | LSM700 | |
| acqua d'uovo | 0,3 g/L di sali marini ' Oceano istantaneo' e 0,5 mM CaSO4 in acqua distillata. | ||
| [intestazione] | |||
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7. Autoclave per 20 min a 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| tampone | 30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Portare a 1 L con acqua distillata. Regolare il pH 7. | ||
| Soluzione | Mescolare 1 ml di siero di cavallo inattivato termicamente con 9 ml di 1X PBSDT. |
Riferimenti
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. New concepts in liver regeneration. J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 1....
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Ristampe e permessi
