Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em> Streptococcus iniae</em> Infección

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

El patógeno acuático, Streptococcus iniae, es responsable de más de 100 millones de dólares en pérdidas anuales para la industria de la acuicultura y es capaz de causar enfermedad sistémica en ambos peces y los seres humanos. Una mejor comprensión de S. iniae patogénesis de la enfermedad requiere un sistema modelo apropiado. La maleabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas tempranas del desarrollo de pez cebra permiten la generación y proyección de imagen no invasiva de las líneas transgénicas con marcados fluorescentemente células inmunes. El sistema inmune adaptativo no es completamente funcional hasta varias semanas después de la fecundación, pero las larvas de pez cebra tienen un sistema inmune innato vertebrados conservadas con neutrófilos y macrófagos. Por lo tanto, la generación de un modelo de infección de larvas permite el estudio de la contribución específica de la inmunidad innata en el control de S. infección iniae.

El sitio de microinyección determinará si hay una infecciónsistémica o localizada inicialmente. A continuación, presentamos nuestros protocolos para inyección vesícula ótica de pez cebra edad de 2-3 días después de la fecundación, así como las técnicas de imagen confocal de fluorescencia de la infección. Un sitio de infección localizada permite la observación de la invasión inicial microbio, el reclutamiento de células huésped y la difusión de la infección. Nuestros resultados utilizando el modelo de larvas de pez cebra de S. infección iniae indican que el pez cebra puede ser usado para examinar las diferentes contribuciones de los neutrófilos y los macrófagos de acogida en las infecciones bacterianas localizadas. Además, se describe cómo photolabeling de las células inmunes puede ser usado para rastrear el destino de la célula huésped individual durante el curso de la infección.

Introduction

Streptococcus iniae es un importante patógeno acuático que es capaz de causar enfermedad sistémica en peces y seres humanos ^1. Aunque S. iniae es responsable de grandes pérdidas en el sector de la acuicultura, también es un potencial patógeno zoonótico, capaces de causar enfermedad en huéspedes humanos inmunocomprometidos con patologías clínicas similares a las causadas por otros patógenos humanos estreptocócicas. Habida cuenta de sus similitudes con patógenos humanos, es importante para estudiar S. iniae patogénesis de la enfermedad en el contexto de un huésped natural. Un modelo de pez cebra adultos de S. infección iniae reveló la infiltración de leucocitos robusta host al sitio localizado de infección, así como un rápido tiempo de acoger la muerte, un tiempo demasiado corto para involucrar al sistema inmune adaptativo ^7. Con el fin de obtener una mirada en profundidad sobre la respuesta inmune innata a S. iniae infección in vivo, es necesario utilizar un modelo que es más susceptible de nen invasiva de imágenes en directo.

El larvas de pez cebra tiene una serie de ventajas que lo hacen un modelo vertebrado cada vez más atractivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El pez cebra son relativamente barato y fácil de usar y de mantener en comparación con los modelos de mamíferos. La inmunidad adaptativa no es funcionalmente maduro hasta 4-6 semanas después de la fecundación, pero las larvas tienen un sistema inmune innato de vertebrados muy conservada con complemento, receptores tipo Toll, citocinas y los neutrófilos y macrófagos con capacidades antimicrobianas incluyendo la fagocitosis y el estallido respiratorio ^{2-6, 8-11.} Además, la tratabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas embrionarias y larvarias de desarrollo permiten la generación de líneas transgénicas estables con las células inmunes marcados con fluorescencia por lo que es posible examinar la interacción huésped-patógeno en tiempo real en vivo. La generación de estas líneas transgénicas utilizando una proteína fotoconvertible tales como DenDRA2 permite el seguimiento de origen célula huésped individual y el destino en el transcurso de la infección ^12.

Cuando se desarrolla un modelo de infección de larvas de pez cebra, el sitio elegido de microinyección determinará si una infección es inicialmente localizado o sistémico. Infecciones de la sangre sistémica en la vena caudal o conducto de Cuvier son los más utilizados para estudiar los patógenos microbianos en el pez cebra y son útiles para el estudio de las interacciones entre el huésped y las células microbianas, las respuestas de citoquinas, y las diferencias en la virulencia entre cepas de patógenos. Para los microorganismos de crecimiento más lento, inyección temprana en el saco vitelino de un embrión en la etapa de 16-1,000 célula puede ser usado para generar una infección sistémica ^13,14, con la etapa de desarrollo óptimo para la microinyección de un microorganismo de crecimiento lento encontrado que entre la etapa de 16-128 células ^15. Sin embargo, la yema inyecciones saco de muchos microbios en las etapas posteriores del desarrollo de acogida tienden a ser letal en tél huésped debido al medio ambiente rico en nutrientes para el microbio y la falta de infiltración de leucocitos ^16-18.

Una infección localizada generalmente resulta en la migración dirigida de los leucocitos hacia el sitio de la infección que puede ser fácilmente cuantificó con imagen no invasiva. Este tipo de infección puede permitir para la disección de los mecanismos que median la migración de leucocitos así como la investigación de diferentes capacidades migratorias y fagocíticas de diversas poblaciones de leucocitos. Las infecciones localizadas también son útiles al examinar las diferencias de virulencia entre las cepas bacterianas, así como el estudio de los mecanismos de invasión de microbios ya que las barreras host físicos deben ser cruzados por una infección localizada para convertirse en sistémica. El pez cebra se eleva típicamente a temperaturas de 25-31 ° C ^19, sino que también puede mantenerse a temperaturas tan altas como 34-35 ° C para los estudios de la invasividad de ciertos patógenos humanos con requisitos estrictos de temperaturapara la virulencia ^{20, 21.}

Muchos sitios diferentes se han utilizado para generar una infección bacteriana localizada inicialmente como el ventrículo cerebro posterior ^22, músculo dorsal de la cola ^18, cavidad pericárdica ^23, y vesícula ótica (oreja) ^{5, 16, 24.} Sin embargo, se ha encontrado que la inyección de bacterias en el músculo de la cola puede causar daños en los tejidos y la inflamación independiente de las bacterias, que pueden sesgar los resultados en la investigación de la respuesta de leucocitos ^13. Aunque menos daño está asociado con la inyección en el cerebro posterior y aunque es inicialmente desprovista de leucocitos en los embriones jóvenes, el ventrículo rombencéfalo gana constantemente más células inmunes con el tiempo como microglia toman la residencia. El ventrículo posterior del cerebro es también un lugar más difícil de imagen. La vesícula ótica es una cavidad hueca cerrada, sin acceso directo a la vasculatura ^{25, 26.} Es normalmente desprovista de leukocytes, pero los leucocitos pueden ser reclutados a la vesícula ótica en respuesta a estímulos inflamatorios, como la infección. También es un sitio preferido de la microinyección de bacterias en 2-3 días de edad después de la fertilización de pez cebra (dpf) debido a la facilidad de formación de imágenes y la visualización de la inyección. Por lo tanto, se optó por la vesícula ótica como nuestro lugar de la infección bacteriana localizada.

Protocol

Adultas y embrionarias pez cebra se mantuvieron de acuerdo con la Universidad de Wisconsin-Madison Centro de Investigación de Recursos Animales. 1. Preparación de microinyección Needles Preparar agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgada (1,0 OD / 0.75 ID) utilizando un dispositivo extractor de micropipeta con los siguientes valores: presión de aire 200, de calor 502, tirar 90, velocidad 80, hora 70, tiempo en el aire en el arranque de la tracción 5, tiempo en el…

Representative Results

La microinyección de S. iniae en la vesícula ótica (Figura 1 y Figura 2) resulta en una respuesta del huésped localizado inicialmente. Cuando se inyecta correctamente, las bacterias sólo deben verse en la vesícula ótica y no en el tejido circundante o de la sangre. Esto puede ser visualizado durante la microinyección usando fenol colorante rojo (Figura 1A). Alternativamente, si se inyectan bacterias marcadas, un análisis rápido de las larvas infectada…

Discussion

El método de infección utilizado aquí es útil para el estudio de la respuesta inmune del huésped a una infección localizada inicialmente en 2-3 embriones y larvas dpf. El enfoque de un estímulo inflamatorio, como una infección, en una cavidad cerrada, como la vesícula ótica permite el estudio de neutrófilos y macrófagos quimiotaxis y la fagocitosis. Una advertencia de la inyección de bacterias en la vesícula ótica es que la capacidad de los neutrófilos para fagocitar eficazmente las bacterias en cavidade…

Materials

1.7 ml eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x 1/2 in. needle	BD Biosciences	305109
96 well plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 mm x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 mm x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144